雌激素上調(diào)錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的：
　　人DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair, MMR)系統(tǒng)在維持基因組穩(wěn)定性中起著關(guān)鍵作用。MMR功能障礙導(dǎo)致的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability, MSI）與許多惡性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，例如Lynch綜合征。此外，約15％的散發(fā)性結(jié)直腸癌(colorectalcancer, CRC)也與MMR功能障礙相關(guān)。流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)證實(shí)雌激素替代治療對(duì)結(jié)直腸癌患者具有保護(hù)性作用。我們的前

2、期研究表明，雌激素的這一作用可能與DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1有關(guān)。MLH1是體內(nèi)最重要的MMR基因之一。然而，雌激素如何調(diào)節(jié)錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1表達(dá)的具體機(jī)制尚不清楚。本研究旨在探討雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的機(jī)制，以及通過(guò)雌激素信號(hào)通路途徑誘導(dǎo)MLH1表達(dá)對(duì)結(jié)直腸腫瘤增殖的影響。
　　第一部分 雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的機(jī)制研究
　　我們的前期研究結(jié)果表明，圍絕經(jīng)期女性的結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)源性MLH1蛋白表達(dá)水平與體內(nèi)血清雌激素濃度

3、呈正相關(guān)關(guān)系，但其MSH2蛋白表達(dá)與血清雌激素濃度無(wú)明顯相關(guān)性。并且，體外研究發(fā)現(xiàn)雌激素可增強(qiáng)結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)MLH1表達(dá)水平，但對(duì)MSH2蛋白表達(dá)影響非常有限。本研究旨在探討雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.在SW480、HT29和LoVo細(xì)胞中過(guò)表達(dá)雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ)，經(jīng)由雌二醇(E2)或者牛血清結(jié)合的雌二醇(BSA-E2)處理，利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time

4、 quantitative Polymerase Chain Reaction，RT Q-PCR)及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)方法從mRNA和蛋白質(zhì)的水平分別檢測(cè)MLH1的表達(dá)情況。
　　2.根據(jù)UCSC(www.geome.ucsc.edu)在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)分析MLH1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，然后利用PCR方法從人基因組DNA中克隆MLH1基因近端啟動(dòng)子（-1953/+53），并插入到雙熒光報(bào)告基因載體pGL3-Basic中

5、，并命名為pGL3-Promoter-luc。然后運(yùn)用熒光報(bào)告基因和染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)的方法檢測(cè)MLH1基因啟動(dòng)子序列中是否存在雌激素應(yīng)答元件。
　　結(jié)果：
　　1.E2在mRNA水平顯著增強(qiáng)三種結(jié)腸癌細(xì)胞株的MLH1基因表達(dá)，但與之相比較，BSA-E2對(duì)該基因的表達(dá)影響非常微弱。此外，雌激素處理細(xì)胞的情況下，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)ERβ對(duì)MLH1在mRNA

6、水平的表達(dá)上調(diào)具有協(xié)同作用(P＜0.001)。
　　2.我們發(fā)現(xiàn)MLH1近端啟動(dòng)子序列存在雌激素相關(guān)作用位點(diǎn)。并且，半雌激素應(yīng)答元件與AP1結(jié)合位點(diǎn)在雌激素誘導(dǎo)MLH1表達(dá)的調(diào)控過(guò)程中都非常重要。
　　結(jié)論：
　　E2誘導(dǎo)MLH1表達(dá)是由ERβ介導(dǎo)，通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分 ERβ在體外和體內(nèi)發(fā)揮抑制結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)的作用
　　據(jù)報(bào)道，ERβ特異性激動(dòng)劑在體外和體內(nèi)具有抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用。

7、另一方面，絕經(jīng)后雌激素替代治療降低了微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定及微衛(wèi)星穩(wěn)定型的結(jié)直腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在明確ERβ介導(dǎo)的MLH1表達(dá)上調(diào)是否能在體外和體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　方法：
　　1.siRNA-shMLH1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480和Caco2細(xì)胞，同時(shí)伴隨或不伴隨ERβ過(guò)表達(dá)，然后分別與溶劑、雌激素或雌激素加ERβ特異性拮抗劑PHTPP孵育，并用5-FU處理細(xì)胞。最后用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　

8、2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，然后采用AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌，并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為2組，每5只一組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別接受DPN（1 mg/kg/日）和等體積溶劑皮下注射。16周后采用頸椎離斷法處死動(dòng)物，取結(jié)直腸，稱(chēng)重并測(cè)量長(zhǎng)度，計(jì)算重量/長(zhǎng)度比值。
　　3.將HT29細(xì)胞(5×106)注射到已切除雙側(cè)卵巢的裸鼠皮下，并將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3個(gè)組，每5只一組。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別接受DPN（1 mg/kg/日）、PHTPP（10-7 mo

9、l/日）和等體積溶劑皮下注射。使用以下公式對(duì)移植瘤體積進(jìn)行監(jiān)測(cè):體積=1/2×（最大直徑）×（最小直徑）2。最終取部分移植瘤組織進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.當(dāng)細(xì)胞內(nèi)源性MLH1蛋白表達(dá)被抑制，5-FU處理后細(xì)胞活性未顯著降低。然而，過(guò)表達(dá)ERβ加E2處理，上調(diào)MLH1表達(dá)水平，從而增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性，細(xì)胞活性顯著下降。
　　2.與溶劑注射組相比，DPN注射組的成瘤數(shù)量更少，結(jié)直腸平均重量/長(zhǎng)度比