hNIS基因轉染人結腸癌細胞建立裸鼠模型介導放射性顯像.pdf

1、目的:
　　鈉/碘轉運體(sodium/iodide symportor，NIS)作為一種主要存在于甲狀腺濾泡細胞基底膜上的跨膜糖蛋白[1]，它能將碘從細胞外逆濃度梯度轉運到細胞內(nèi)。它的這種濃聚碘的能力是甲狀腺激素生物合成、臨床上診斷性甲狀腺核素顯像以及甲狀腺功能亢進和甲狀腺腫瘤放射性碘治療的基礎[2]。
　　臨床上利用放射性碘(131I)是治療甲狀腺惡性腫瘤的重要手段之一，它發(fā)揮殺傷腫瘤細胞效應的基礎是——腫瘤細胞必須具有

2、攝碘功能。遺憾的是，臨床上少部分高分化和大部分低分化甲狀腺癌及其轉移灶聚碘能力低下，此外還有其他非甲狀腺腫瘤細胞更無聚碘功能，這使得131I治療起不到良好的作用。
　　結腸癌為我國惡性腫瘤第三位[3]，死亡率僅次于肺癌和肝癌。起病隱匿，而且早期通常沒有明顯的臨床表現(xiàn)，等出現(xiàn)明顯癥狀時大多已到了中晚期。此時，由于其生物學特性復雜且惡性程度高，且化療的多重耐藥性令其預后不理想，進展期結腸癌的治療一直都不理想。
　　結合基因轉染技

3、術和核素放射性治療，可在hNIS低表達或者不表達的腫瘤實現(xiàn)放射性核素治療，為惡性腫瘤的治療開辟了全新的診治途徑。我們設想將鈉/碘轉運體重組質(zhì)粒(pcDNA3.1+-hNIS)通過脂質(zhì)體轉染法轉染至SW480結腸癌細胞中，使原本不表達hNIS的腫瘤細胞表達hNIS蛋白，從而獲得一定程度的攝碘能力，然后建立動物模型，進行分子顯像，為進一步的核素治療打下基礎。
　　方法:
　　1.對已經(jīng)構建好的重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS

4、進行測序;BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定;轉化到大腸桿菌中，進行擴增以及提取。
　　2.培養(yǎng)SW480細胞并分組，脂質(zhì)體法轉染重組質(zhì)粒至SW480細胞;半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Western Blot方法(WB)檢測轉染細胞hNIS基因和蛋白的表達情況。
　　3.轉染重組質(zhì)粒后的SW480細胞，經(jīng)抗生素G418篩選，獲得穩(wěn)定表達hNIS基因的細胞系(hNIS-SW480)。
　　4.體外攝131I試

5、驗及過氯酸鹽抑制實驗;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　5.細胞株hNIS-SW480接種到BALB/C-nu/nu裸鼠肩胛骨處皮下，設立對照組;接種同時開始在裸鼠飲水中加入優(yōu)甲樂(L-T4)施行甲狀腺封閉;待皮下移植瘤直徑約達到約15mm，腹腔內(nèi)注射99mTcO4-和131I分別進行顯像。
　　6.取出裸鼠皮下腫瘤組織進行WB檢測。
　　結果:
　　1.對pcDNA3.1+

6、-hNIS重組質(zhì)粒進行雙向測序，得到插入基因序列全長1944bp（含起始密碼子ATG到終止密碼子TGA共643個氨基酸）且大小和方向正確，與參考序列H.sapiens solute carrier family5(sodium iodide symporter),(GenBank accession: NM-000453)的CDS序列完全匹配。
　　2.BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切之后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物，結果顯示，在19

7、44bp和5405bp左右有兩清晰電泳條帶，與理論結果相符，證實本次構建質(zhì)粒確實為重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS。擴增后提取質(zhì)粒電泳可見，在7000bp左右有清晰條帶，BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切電泳亦在1944bp和5405bp左右見清晰條帶，說明提取質(zhì)粒成功。
　　3.SW480細胞轉染后RT-PCR顯示轉染組可見擴增的369bp左右條帶，而在對照組和空白質(zhì)粒組均未檢測到hNIS mRNA的表達;SW480細胞轉染后WB

8、電泳顯示在轉染組可見70kd左右條帶，而在對照組和空白質(zhì)粒組均未檢測到hNIS蛋白的表達。這說明本實驗轉染SW480細胞成功。
　　4.轉染組SW480細胞經(jīng)抗生素G418篩選后獲得穩(wěn)定表達細胞系(hNIS-SW480)，它對G418的最終耐受濃度為300μ g/ml，空白對照組與空質(zhì)粒組對G418沒有抗性。
　　5.測15μCi131I孵育(hNIS-SW480)細胞系在(4h、8h、16h、24h、36h、48h)時段的

9、攝131I能力，結果表明轉染組細胞4h-24h攝131I碘曲線呈上升趨勢，24小時攝碘達高峰，24h-48h攝131I碘曲線呈緩慢遞減。而空白對照組與空白質(zhì)粒組各時段的攝131I碘曲線未見顯著變化。15uCi131I孵育24小時，轉染組比空白對照組與空白質(zhì)粒組的攝131I能力均增高約8倍(P＜0.05)。
　　6.未加入NaClO4的hNIS-SW480細胞系具有較高攝131I能力，加入NaClO4的(hNIS-SW480)細胞系

10、攝131I能力明顯受到抑制，攝131I能力降低約10倍(P＜0.05)，證明轉染組的攝碘功能確實為hNIS基因所表現(xiàn)的功能。
　　7.細胞凋亡率結果提示，轉染組16h早期凋亡顯著，24h晚期凋亡顯著升高;轉染組凋亡指數(shù)高于空白對照組與空白質(zhì)粒組。說明131I對轉染hNIS-SW480細胞系具有顯著殺傷效果。
　　8.建立裸鼠結腸癌模型，施行甲狀腺封閉后，裸鼠皮下移植瘤直徑約達到15mm時，應用SPECT進行放射性核素99mT

11、cO4-顯像，轉染組可見移植瘤處明顯濃聚，對照組未見明顯顯像。
　　9.放射性核素131I顯像可見轉染組裸鼠移植瘤部位有明顯131I濃集，對照組未見明顯濃聚。
　　10.裸鼠皮下移植瘤組織的WB結果顯示確實有hNIS蛋白的表達。
　　結論:
　　本研究使用質(zhì)粒將hNIS基因轉染入不攝碘的結腸癌SW480細胞系中，使原來不攝碘的結腸癌細胞攝碘，然后進行SPECT分子顯像。在體外及體內(nèi)條件下均證明轉染hNIS基因成功