5’-脫氧氟尿苷聯(lián)合干擾素對(duì)轉(zhuǎn)染胸苷磷酸化酶基因結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠绊?pdf

1、胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）是嘧啶核苷合成和分解過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。目前學(xué)界的研究認(rèn)為T(mén)P與血小板源性?xún)?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（platelet-derived endothelial cell growth factor，PD-ECGF）具有同源性，其誘導(dǎo)血管形成和抗凋亡的作用與結(jié)直腸腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。同時(shí)TP也是使5'-脫氧氟尿苷（5’-deoxy-5-fluorouridine，5'-D

2、FUR）、卡培他濱（capecitabine， CAP）等5-FU前體藥物轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），干擾細(xì)胞DNA的合成、發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵酶，其活性與結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶前體類(lèi)藥物的敏感性及靶向治療密切相關(guān)。因此TP在結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有著雙重作用。
　　大量臨床研究證實(shí)，在腫瘤組織中TP的活性明顯高于周?chē)恼＝M織，但在不同的腫瘤組織中，TP表達(dá)的具體部位、活性卻不盡相同。關(guān)于

3、結(jié)直腸癌及轉(zhuǎn)移組織中表達(dá)TP的具體部位報(bào)道各異。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在人結(jié)直腸癌組織中，TP蛋白主要由間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，尤其是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor associated macrophage，TAM），而非腫瘤細(xì)胞本身。近年來(lái)的研究表明干擾素-α2a（interferon-α2a，IFN-α2a）可上調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞LOVO和LS174T中TP的mRNA表達(dá)水平。提示臨床上可通過(guò)應(yīng)用這些細(xì)胞因子增強(qiáng)5'-DFUR的化療效果。
　　5

4、-FU是臨床上用于消化道惡性腫瘤化療的主要藥物，但因有嚴(yán)重的副作用而使其臨床應(yīng)用受到一定的限制。近年被其前體藥物如5'-DFUR、卡培他濱等逐漸代替，這些前體藥物本身無(wú)細(xì)胞毒性作用，只有在腫瘤組織中被關(guān)鍵酶TP轉(zhuǎn)化為5-FU后才能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。這樣既有效的抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，又消除了潛在的血管生長(zhǎng)因子，實(shí)現(xiàn)了抗腫瘤生長(zhǎng)與抗腫瘤血管生成的統(tǒng)一。因此提高腫瘤組織內(nèi)TP的表達(dá)有利于提高此類(lèi)藥物的抗腫瘤效應(yīng)，我們前期研究發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中，將

5、TP基因通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞后，顯著提高了5'-DFUR對(duì)LOVO、HT29、LS174T細(xì)胞株的抑制效果，聯(lián)用干擾素-α2a可以使LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)化5'-DFUR為5-FU的能力進(jìn)一步增強(qiáng)，提高5'-DFUR對(duì)該腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
　　本實(shí)驗(yàn)我們采用慢病毒為載體將TP基因轉(zhuǎn)入結(jié)直腸癌LS174T細(xì)胞株中，然后接種于裸鼠背部制作裸鼠結(jié)腸癌模型，利用5'-DFUR、5-FU聯(lián)合干擾素α2a對(duì)轉(zhuǎn)染TP前后裸鼠結(jié)腸癌模型進(jìn)行治療，

6、最后處死裸鼠、留取腫瘤標(biāo)本做石蠟切片免疫組織化學(xué)染色，觀察轉(zhuǎn)染TP基因前后腫瘤組織內(nèi)TP、VEGF、CD34表達(dá)的不同。
　　目的:
　　探索在轉(zhuǎn)染TP基因的裸鼠結(jié)直腸癌腫瘤模型中，干擾素-α2a對(duì)TP表達(dá)、微血管生成，及對(duì)5`-DFUR與5-FU抗腫瘤作用方面的影響。
　　方法:
　　以慢病毒為載體將TP基因轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T，得到穩(wěn)定的TP高表達(dá)細(xì)胞株LS174T-TP，并傳5代后在流式細(xì)胞儀上檢

7、測(cè)其轉(zhuǎn)染率。將96只BALB/c裸鼠分成2組，每組48只，分別應(yīng)用野生型、及轉(zhuǎn)染TP基因后的LS174T-TP細(xì)胞株接種裸鼠背部皮下，分別制作裸鼠結(jié)腸癌TP低、高表達(dá)模型。每組再隨機(jī)分為6小組，分別應(yīng)用（1）生理鹽水（對(duì)照）、（2）干擾素-α2a、（3）5-FU、（4）5-FU+干擾素-α2a、（5）5’-DFUR、（6）5’-DFUR+干擾素-α2a，進(jìn)行干預(yù)，連續(xù)用藥5天，并對(duì)裸鼠體重進(jìn)行測(cè)量、記錄，觀察其狀態(tài)。2周后處死各組裸鼠，

8、分離皮下腫瘤稱(chēng)重后，用福爾馬林液固定、石蠟包埋、切片后分別應(yīng)用鼠抗人CD34、VEGF和抗PD-ECGF單克隆抗體對(duì)腫瘤進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)其腫瘤組織內(nèi)TP表達(dá)、VEGF、腫瘤微血管密度（microvesseldensity,MVD）在不同處理組之間的差異。
　　結(jié)果:
　　以慢病毒為載體將TP轉(zhuǎn)染進(jìn)LS174T細(xì)胞株后，傳5代后、各代轉(zhuǎn)染率均在95％以上。所有接種結(jié)腸癌細(xì)胞的裸鼠均成功建立模型，且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)中途死

9、亡個(gè)體。5天給藥結(jié)束后，相比各自對(duì)照組，兩種裸鼠模型中，5-FU組與5-FU+干擾素α組裸鼠體重明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；5’-DFUR組與5’-DFUR+干擾素α組體重也有輕度降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在野生型LS174T裸鼠荷瘤模型中，使用抗腫瘤藥的3~6組腫瘤重量與對(duì)照組相比均明顯降低，抑癌率分別為48%、27%、48%、57%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。其中5'-DFUR組（48%）與5'-DFUR

10、+干擾素α組（57%）、5-FU+干擾素α組與5'-DFUR+干擾素α組（27%與57%）比較抑癌效率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。5-FU組與5-FU+干擾素α組對(duì)比，抑癌效率之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），在LS174T-TP細(xì)胞株裸鼠模型中，5'-DFUR組、5'-DFUR+干擾素α組抑癌率分別為27%、48%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；5'-DFUR組與5-FU組、5'-DFUR+干擾素α組與5-FU+干擾素

11、α組之間對(duì)比，5'-DFUR治療效果更好（27%、48%VS7%、3%），且差異之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而使用5-FU的兩組未顯示出良好的抗腫瘤效果（7%、3%）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TP基因后，裸鼠腫瘤組織中TP的表達(dá)上升，微血管密度增加。而使用干擾素-α2a后腫瘤組織中的TP表達(dá)、MVD差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　轉(zhuǎn)染TP基因后,LS174T細(xì)胞株裸鼠模型的TP表達(dá)顯著增強(qiáng)，有效提高了5'-DF