TLR4及其信號通道在小鼠視神經(jīng)損傷后的作用及機制研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的再生問題一直是醫(yī)學研究的難點和熱點問題，視神經(jīng)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，由于其特殊的生理特性而成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的代表。故探討視神經(jīng)損傷后的修復問題，不僅對視功能的恢復也對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后功能的恢復有著重要意義。目前視神經(jīng)損傷后大量研究集中在如何促進神經(jīng)細胞再生，抑制或去除抑制神經(jīng)細胞再生的不利因素，盡管取得了較大成就，但是對于損傷后神經(jīng)的再生仍存在較多問題。大量研究表明，炎癥反應在創(chuàng)傷性中樞

2、神經(jīng)損傷后的繼發(fā)性腦損害過程中發(fā)揮重要作用。
　　 目前已發(fā)現(xiàn)多種細胞因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、化學因子、粘附分子等參與炎癥過程，并加重神經(jīng)損害。但迄今有關機理研究仍無突破性進展，尚不能給以有效地臨床指導。且上述炎癥分子均是其下游事件，據(jù)推測TLR4可能作為炎癥反應網(wǎng)絡中的急性炎癥反應損傷的扳機點啟動這種病理過程。近年來，隨著對

3、革蘭氏陰性細菌的外膜成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)引起器官組織嚴重炎癥反應機理研究的深入，機體固有性免疫細胞(如小膠質細胞)表達的Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)，在炎癥反應中的作用和機理，引人關注。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS與TLR4特異結合，可激活TLR4，引起細胞活化，通過復雜的調控機理，引起下游多種細胞因子的產(chǎn)生和釋放，導致炎癥反應。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有性免疫功能，主要由小膠

4、質細胞完成，而炎癥因子的釋放主要是通過TLR4-NF-κB信號傳導途徑。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)TLRs也出現(xiàn)在沒有外源性病原體入侵的情況，TLR4配體除了LPS之外，熱休克蛋白(HSP60、70)，壞死細胞碎片等也是其配體。而神經(jīng)外傷后，在軸突損傷周圍也發(fā)現(xiàn)HSP60、70的出現(xiàn)。這一結果提示：和感染一樣，外傷也可能通過某種機制，上調CNS小膠質細胞TLR4的表達，在創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后參與調控炎癥反應。
　　 早于1988年Hash

5、imot等在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一類屬于Ⅰ型跨膜蛋白的受體，命名為TLRs。TLRs是與果蠅Toll蛋白具有同源性的受體蛋白家族，不僅參與果蠅的胚胎發(fā)育過程，還在成年果蠅的免疫防御中發(fā)揮重要作用。1997年和1998年，Medazhitov和Rock等克隆出了另外一種Toll的同源物，即如今的TLR4蛋白。
　　 最初，TLRs介導的細胞應答一直被認為是促炎的宿主防御應答，主要是消滅入侵的病原體，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而研究發(fā)現(xiàn)TLRs也

6、出現(xiàn)在沒有外源性病原體入侵的情況，例如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，多發(fā)性硬化癥等神經(jīng)變性疾病。TLRs在CNS中主要在小膠質細胞和星形膠質細胞表達，當小膠質細胞激活后，TLRs即迅速出現(xiàn)。而研究發(fā)現(xiàn)在視神經(jīng)損傷后，小膠質細胞即被迅速激活。因此，當視神經(jīng)損傷后，視網(wǎng)膜、視神經(jīng)小膠質細胞TLR4的表達變化、意義，以及其引起炎癥鏈式瀑布反應的機理研究，對這一系列問題的探討，對于進一步認識創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)

7、膜及視神經(jīng)繼發(fā)性損害的發(fā)生機理，制定有效的診斷和治療措施，有重要意義。
　　 現(xiàn)在認為，TLR4信號通道主要包括MyD88依賴和非依賴信號通道(TRIF通道)。而在神經(jīng)損傷后，活化的TLR4具體通過哪一條信號通道傳遞，不得而知。有可能通過TLR4激活的兩條信號通道在各自介導的炎癥反應中發(fā)揮著獨特的作用。
　　 以往的研究認為，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是調控炎癥反應強弱的核心，它受各種

8、物理及生化因子激活，誘導多種炎癥因子和酶等基因的表達，介導瀑鏈式炎癥反應的形成、發(fā)展及惡化。TLR4是LPS受體，早期識別侵入體內的G-細菌并通過LPS-TLR4-NF-κB信號傳導途徑啟動炎癥反應，目前傾向認為，TLR4-NF-κB信號傳導途徑，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)一些病理狀態(tài)的發(fā)病基礎。那么，對于創(chuàng)傷性視神經(jīng)損傷后，發(fā)生的炎癥反應是否也主要通過TLR4-MyD88-NF-κB信號傳導途徑啟動，并產(chǎn)生炎癥因子IL-6，TNF等，介導對視網(wǎng)

9、膜、視神經(jīng)的炎性損傷，尚未見報道。
　　 因此，本研究旨在圍繞小膠質細胞TLR4表達變化、意義及信號通道對炎癥的調控這一中心問題深入展開，并明確TLR4在視神經(jīng)損傷后再生修復中的作用。
　　 方法：本研究利用BALB/c小鼠建立視神經(jīng)損傷模型，通過免疫組化及western blot實驗證實TLR4在視神經(jīng)損傷后表達；通過對小鼠視神經(jīng)損傷后不同時間點的觀察，利用western blot及熒光定量PCR明確TLR4及其信號通

10、路的部分關鍵分子在蛋白水平及mRNA水平的表達及變化趨勢；通過對TLR4基因突變及野生型小鼠視神經(jīng)鉗夾損傷的對比研究，利用熒光金標記RGC觀察其凋亡情況，以及觀察神經(jīng)再生修復的關鍵蛋白GAP-43在視神經(jīng)上的表達變化，明確TLR4在視神經(jīng)損傷后再生修復中的作用及機制。通過以上研究，以此希望為輔助治療視神經(jīng)損傷后的再生修復奠定實驗基礎。
　　 主要結果和結論如下：
　　
　　 1、小鼠視神經(jīng)鉗夾傷后視神經(jīng)表達TL

11、R4，隨著損傷時間延長，在視神經(jīng)、視網(wǎng)膜上的表達逐漸增加，并在2周左右達到高點，到第3、4周，TLR4的表達仍處于較高水平。提示TLR4激活在視神經(jīng)損傷后介導的無菌性炎癥反應中發(fā)揮著一定作用。
　　 2、小鼠視神經(jīng)損傷后，小膠質細胞立即被激活，其活化標志物Macl表達在視神經(jīng)和視網(wǎng)膜上急劇增加，其后緩慢降低，并在第3、4周仍維持在較高水平。提示小膠質細胞的活化介導了視神經(jīng)損傷后的無菌性炎癥反應，且小膠質細胞的活化與TLR4的激活

12、相輔相成。
　　 3、小鼠視神經(jīng)損傷后MyD88分子在視神經(jīng)上的表達逐漸升高，其蛋白和mRNA在傷后2、3周處于高水平；而TRIF分子在視神經(jīng)上的蛋白和mRNA表達水平變化不明顯。小鼠視神經(jīng)損傷后，效應分子NF-κB和炎性因子IL-6、TNF-α在視神經(jīng)上的表達逐漸增加，并在傷后2、3周處于高水平。結果提示小鼠視神經(jīng)損傷后TLR4信號主要通過TLR4-MyD88-NF-κB通道傳遞，是視神經(jīng)損傷后產(chǎn)生無菌性炎癥反應的一條重要通道