2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、由模式識(shí)別受體(pathogen recognition receptors,PRRs)識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-asociated molecular patterns,PAMPs)而引起的天然免疫反應(yīng)是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線。當(dāng)病毒進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的PRR——維甲酸誘導(dǎo)基因(retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)樣受體(RIG-Ⅰ like receptors,RLRs

2、)家族成員識(shí)別,而激活下游一系列信號(hào),導(dǎo)致干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatoryfactor, IRF)3和IRF7的磷酸化激活和二聚體的形成,從而起始Ⅰ型干擾素(typeⅠinterferon,IFN-Ⅰ)的產(chǎn)生,最終誘導(dǎo)下游抗病毒效應(yīng)蛋白的表達(dá)和獲得性免疫反應(yīng)的激活。RLR家族的兩個(gè)重要的成員RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化基因5(melanomadifferentiation-associated gene,MDA5)

3、具有廣泛的識(shí)別病毒核酸的功能,在抗病毒先天性免疫中起到非常重要的的作用。但有意思的是,RIG-Ⅰ同源基因在某些魚(yú)類(lèi)[如大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)]、雞(Gallus gallus)和中國(guó)樹(shù)鼩(Tupaia belangerichinensis)的基因組中沒(méi)有被鑒定到,而MDA5同源基因幾乎存在于所有被研究的脊椎動(dòng)物中。這似乎暗示RIG-Ⅰ和MDA5的功能存在冗余性。目前的研究表明RIG-Ⅰ與MDA5在識(shí)別的核酸類(lèi)

4、型上存在差異,對(duì)某些病毒的識(shí)別存在冗余,但人們對(duì)二者在Ⅰ型IFN誘導(dǎo)作用方面的差異性卻知之甚少。
  草魚(yú)(grass carp,Ctenopharyngodon idella)是我國(guó)“四大家魚(yú)”之一,其養(yǎng)殖業(yè)長(zhǎng)期以來(lái)受到各種疾病的困擾。由雙鏈RNA(double strand RNA,dsRNA)病毒——草魚(yú)呼腸孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)引起的草魚(yú)出血病嚴(yán)重影響著草魚(yú)種的成活率,因此GCRV和草魚(yú)

5、抗病毒免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期以來(lái)受到科研人員的廣泛關(guān)注。在研究過(guò)程中,草魚(yú)的RIG-Ⅰ和MDA5基因也被克隆和鑒定出來(lái),并且被證明在抗GCRV感染中發(fā)揮著積極的作用。最近,隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,草魚(yú)的IFN成員被充分地挖掘并鑒定出來(lái)。草魚(yú)Ⅰ型IFN包括四個(gè)成員,即IFN1、IFN2、IFN3和IFN4;而Ⅱ型IFN包含兩個(gè)成員,即IFN-γrel和IFNγ。人們對(duì)其他魚(yú)類(lèi)各IFN的研究表明不同的IFN在功能上存在差異,但對(duì)各IFN的誘導(dǎo)通路的

6、認(rèn)識(shí)還比較模糊,草魚(yú)這6種IFN在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)模式也還不清楚。因此我們想利用草魚(yú)腎細(xì)胞系(C.idella kidney,CIK)為研究對(duì)象,來(lái)探究草魚(yú)IFN的表達(dá)特征;重點(diǎn)用GCRV感染CIK細(xì)胞,來(lái)研究草魚(yú)RIG-Ⅰ和MDA5在IFN誘導(dǎo)方面的差異性。
  我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)技術(shù),發(fā)現(xiàn)未受到免疫刺激的CIK細(xì)胞中IFN1和I

7、FN3基因相對(duì)表達(dá)量較高,IFN-γrel和IFNγ基因表達(dá)量居中,IFN2和IFN4基因表達(dá)量較低;在GCRV或dsRNA類(lèi)似物poly(I∶C)刺激細(xì)胞后,各IFN和代表性IFN刺激基因(IFN-stimulatedgenes,ISGs)的表達(dá)量在草魚(yú)MDA5過(guò)表達(dá)細(xì)胞中顯著高于RIG-Ⅰ過(guò)表達(dá)細(xì)胞;而且MDA5過(guò)表達(dá)比RIG-Ⅰ過(guò)表達(dá)更為強(qiáng)烈地促進(jìn)了各IFN啟動(dòng)子活性。為了探究產(chǎn)生這種現(xiàn)象是否與IRF3和IRF7相關(guān),我們又利用細(xì)

8、胞活力檢測(cè)、RT-qPCR和免疫印跡(immunoblotting,IB)技術(shù)證明了草魚(yú)IRF3和IRF7在GCRV感染后由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核遷移,并在細(xì)胞抗GCRV感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
  隨后我們使用半定量(semi-qPCR)、雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)、IB技術(shù)發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞未受到免疫刺激時(shí),RIG-Ⅰ和MDA5的過(guò)表達(dá)不會(huì)影響IRF3和IRF7的表達(dá);但在細(xì)胞受到免疫刺激時(shí),RIG-Ⅰ和MDA5的過(guò)表達(dá)會(huì)在蛋白水平上顯著促進(jìn)I

9、RF3和IRF7的表達(dá),并上調(diào)了它們的磷酸化水平。之后,我們使用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和IB技術(shù)深入研究了草魚(yú)RIG-Ⅰ和MDA5對(duì)IRF3和IRF7的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),RIG-Ⅰ和MDA5過(guò)表達(dá)促進(jìn)了IRF3和IRF7的絲氨酸磷酸化;不同的是,MDA5同時(shí)也促進(jìn)了IRF7的蘇氨酸磷酸化,但RIG-Ⅰ卻抑制了IRF7的蘇氨酸磷酸化。這一現(xiàn)象導(dǎo)致的結(jié)果是:RIG-Ⅰ和MDA5過(guò)表達(dá)促進(jìn)了IRF3與IRF7的

10、異源二聚化,同時(shí)MDA5過(guò)表達(dá)也促進(jìn)了IRF7的同源二聚化,但RIG-Ⅰ過(guò)表達(dá)卻削弱了IRF7的同源二聚化作用。隨后為了探究草魚(yú)IRF3和IRF7二聚化對(duì)各IFN表達(dá)的影響,我們運(yùn)用了雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)。結(jié)果表明:IRF3的同源二聚化僅促進(jìn)了IFN1的啟動(dòng)子活性,而IRF3和IRF7的異源二聚以及IRF7的同源二聚更為廣泛而強(qiáng)烈地促進(jìn)了Ⅰ型IFN的啟動(dòng)子活性。由此說(shuō)明了IRF7的同源二聚在Ⅰ型IFN啟動(dòng)誘導(dǎo)中的重要作用,也闡明了RIG-

11、Ⅰ比MDA5對(duì)IFN表達(dá)的誘導(dǎo)作用弱的分子機(jī)制。最后,我們又利用RT-qPCR技術(shù)證明MDA5過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)的白介素4(in terleukin4,IL-4)和IL-12p40基因表達(dá)量顯著高于RIG-Ⅰ過(guò)表達(dá)所誘導(dǎo)的表達(dá)量,從而為MDA5誘導(dǎo)了更高的Ⅱ型IFN基因表達(dá)提供了理論依據(jù)。
  本研究表明草魚(yú)MDA5比RIG-Ⅰ誘導(dǎo)的IFN免疫反應(yīng)更為強(qiáng)烈,為RIG-Ⅰ和MDA5在功能上的冗余性提供了證據(jù),同時(shí)也解釋了為什么RIG-Ⅰ同源

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