小鼠肝干細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、該課題致力于從損傷后的成體肝臟中分離并長(zhǎng)期培養(yǎng)具有雙向分化潛能的肝干細(xì)胞,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究.最近,Gordon GJ等報(bào)道了一種新的肝臟再生反應(yīng),他們首先用倒千里光堿(Retrorsine)抑制大鼠成熟肝細(xì)胞的再生能力,然后通過肝2/3切除施以肝臟強(qiáng)大的再生刺激.肝臟再生過程中,肝實(shí)質(zhì)中會(huì)產(chǎn)生一種集落樣增殖的"小肝細(xì)胞樣原始細(xì)胞"(Small Hepatocyte-Like Progenitor Cells,SHPCs),并通過

2、這種細(xì)胞的增殖和分化完成肝臟的再生.該研究采用類似的方法損傷小鼠的肝臟,發(fā)現(xiàn)小鼠的肝再生反應(yīng)與大鼠不同.在小鼠再生肝中并沒有觀察到從形態(tài)學(xué)上可以分辨的"小肝細(xì)胞樣原始細(xì)胞",但是有明顯的膽管反應(yīng)和卵圓細(xì)胞增殖.采用兩步膠原酶消化法從損傷后的再生肝中分離細(xì)胞,經(jīng)過長(zhǎng)期的培養(yǎng)和不斷的純化,最終在體外建立了形態(tài)均一的連續(xù)細(xì)胞系.該細(xì)胞系是典型的上皮樣細(xì)胞,體外生長(zhǎng)時(shí)成"鋪路石"樣排布;在電鏡下觀察,細(xì)胞核質(zhì)比大,胞漿中除一些線粒體和核糖體外缺

3、管乏其他細(xì)胞器;在體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞可以保持不分化狀態(tài),表達(dá)卵圓/膽管細(xì)胞的分子標(biāo)志,如CK14、CK19,OV6,OC.10,c-met等;還表達(dá)造血干細(xì)胞的分子標(biāo)志,如Thy-1,c-kit,CD45等.這表明該細(xì)胞具有肝干細(xì)胞的分子表型,并因此將其命名為肝上皮樣原始細(xì)胞(Liver Epithelial Progenitor Cells,LEPCs).DMSO和丁酸鈉是兩種最常用的小分子細(xì)胞分化細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑.在丁酸鈉作用下,LEPC

4、s的生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制,細(xì)胞體積增大,核質(zhì)比減小.誘導(dǎo)后第四天,有雙核細(xì)胞產(chǎn)生.電鏡下觀察,胞漿中的細(xì)胞器較誘導(dǎo)前明顯增多,有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基本以及大量的核糖體和糖原顆粒.在細(xì)胞與細(xì)胞之間還觀察到了肝細(xì)胞特征性的細(xì)胞間膽管結(jié)構(gòu).免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明,誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)成熟肝細(xì)胞功能性的分子標(biāo)志,如白蛋白、AldolaseB、APO A4、APO B、ADH等.這有力的證明了在丁酸鈉作用下,LEPCs可以被誘導(dǎo)分化為成熟肝細(xì)胞.胞外基質(zhì)

5、對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為有著巨大的影響,Mateigel基質(zhì)膠被廣泛的應(yīng)用于多種細(xì)胞類型的體外分化.將培養(yǎng)的LEPCs接種于鋪有Mateigel基質(zhì)膠的培養(yǎng)皿后,細(xì)胞很快聚集成團(tuán)并向四周放射狀生長(zhǎng)出許多管狀結(jié)構(gòu),在電鏡下可觀察到細(xì)胞團(tuán)中包括膽管樣結(jié)構(gòu).肝干細(xì)胞量本質(zhì)的特征在于具有向成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化的雙向潛能.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LEPCs可以分化為成熟肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞分化的雙向潛能.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LEPCs可以分為成熟肝細(xì)胞和膽

6、管上皮細(xì)胞,具有肝干細(xì)胞的特征.采用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染手段,將LEPCs標(biāo)記LacZ、EGFP和DsRED作為報(bào)告基因.將標(biāo)記后的細(xì)胞移植到小鼠損傷后的肝臟中研究了LEPCs在體內(nèi)的分化走向.發(fā)現(xiàn)LEPCs可以在肝臟的微環(huán)境中分化為成熟的肝細(xì)胞并嵌和進(jìn)入肝實(shí)質(zhì),在形態(tài)學(xué)上與臨近肝細(xì)胞不可區(qū)分.這進(jìn)一不證明了LEPCs是一種來(lái)自小鼠損傷肝臟的肝干細(xì)胞系.同時(shí)也展示了肝干細(xì)胞在肝損傷性疾病治療方面的潛在應(yīng)用價(jià)值.我們首次從倒千里光堿損