pIRES介導的CD、TK雙自殺基因構建及其對腺樣囊性癌細胞殺傷作用的實驗研究.pdf

1、目的：腺樣囊性癌(adenoidcysticcarcinoma)又稱圓柱瘤(cylindroma)，由Billroth首次報道，多數(shù)人認為腫瘤來自涎腺導管，也可能來自口腔粘膜的基底細胞。腺樣囊性癌占涎腺腫瘤的5﹪～10﹪，在涎腺惡性腫瘤中占24﹪，其中在頜下腺及舌下腺中是居首位的惡性腫瘤，最多見的年齡是40～60歲。其主要的病理學特點為嗜神經(jīng)侵犯及易于遠處轉移，目前對腺樣囊性癌多主張采用手術聯(lián)合放化療的綜合治療為主，其五年生存率一般在6

2、0﹪左右，其10年、15年、20年生存率分別為30～39﹪、24～26﹪、12.5～21﹪，其療效仍然不能令人滿意。因此，探討新的治療方法具有極其重要的意義。 近年來腫瘤的基因治療發(fā)展迅速，主要的方法有自殺基因、免疫基因、多藥耐藥基因以及抗血管生成基因等。其中自殺基因被認為是最有前景的基因治療方法之一。自殺基因治療(Suicidegenetherapy)又稱酶/藥物體前體療法(enzyme-prodrugtherapy，EPT)

3、，是利用轉基因技術將哺乳動物中所不含有的自殺基因轉入到哺乳動物腫瘤細胞中，該基因表達的產物可將無毒性的藥物前體轉化為毒性藥物，從而選擇性的殺傷腫瘤細胞，常用的自殺基因有單純皰疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HSV-TK)基因和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶(E.coli-cytosinedeaminase，CD)基因，前者催化無毒性抗病毒核苷類似物如丙氧鳥苷(GCV)、無環(huán)鳥苷(ACV

4、)等成為單磷酸核苷衍生物(dTMP)，然后在內源性細胞激酶作用下轉化為有明顯毒性的三磷酸核苷(dTTP)，作為DNA合成鏈的終止劑，干擾細胞DNA的合成[1,2.20]；后者編碼的胞嘧啶脫氨酶可催化5-氟胞嘧啶(5-FC)脫氨為5-氟尿嘧啶(5-FU)，然后代謝為有毒性的5-氟尿嘧啶-5'三磷酸(5-FUTP)和5-氟-2'脫氧尿嘧啶-5'三磷酸(5-FdUTP)，5-FUTP通過與UTP競爭性結合而抑制mRNA和tRNA的合成，5-F

5、dUTP則作用于胸苷合成酶(TS)，導致TMP的衰竭而阻止DNA的合成，最終誘導腫瘤細胞的凋亡[3,4,19]。已有的研究證實聯(lián)合基因治療具有單自殺基因無可比擬的優(yōu)越性，越來越受人們關注。 本研究旨在構建真核表達質粒pIRES-CD及pIRES-TK，并共同轉染ACC-2細胞，并應用前體藥物治療，探討其對ACC-2細胞的殺傷作用及旁觀者效應，以尋求有效的自殺基因治療方法。 方法首先根據(jù)CD、TK的DNA序列分別設計、合成

6、引物，并將擴增后產物分別插入克隆載體pMD18-T中，獲得重組質粒pMD18-T-CD及pMD18-T-TK，并進行PCR篩選及重組質粒的酶切分析，然后插入經(jīng)相應酶切的真核表達載體pIRES，獲得重組表達質粒pIRES-CD及pIRES-TK，并進行菌落PCR初步鑒定及重組質粒的酶切分析。然后以電穿孔方法將重組表達質粒pIRES-CD及pIRES-TK轉染ACC-2細胞，新霉素(GeneticinG418)篩選后獲得穩(wěn)定表達的ACC-2

7、/CD-TK細胞，并經(jīng)RT-PCR鑒定CD、TK是否整合到ACC-2細胞DNA鏈中并轉錄表達。分組進行前體藥物(GCV/5-FC)治療，加入不同濃度的GCV及5-FC對ACC-2/CD-TK細胞和ACC-2細胞進行處理，并以未加藥組作對照，MTT法檢測藥物的殺傷效果及其對ACC-2細胞體外生長增殖的影響，計算細胞生長抑制率(GIR)及半數(shù)抑制濃度(IC50)；并觀察ACC-2/CD-TK與ACC-2細胞在不同混育比例、不同混育時間下應用

8、同一濃度的GCV及5-FC對腺樣囊性癌的殺傷作用；并用流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期比例的變化及細胞凋亡的情況；同時觀察ACC-2/CD-TK細胞和ACC-2細胞在不同混育比例下GCV、5-FC單獨及聯(lián)合應用所產生的旁觀者效應(即殺傷轉染腫瘤細胞的同時，通過擴散作用殺傷臨近未轉染自殺基因的腫瘤細胞)。 結果成功克隆了大腸桿菌CD基因和HSV-TK基因，并進行了DNA序列分析，和基因庫報道的基因序列基本一致，然后將克隆的CD基因

9、和HSV-TK基因分別插入克隆載體pMD18-T，后將重組的克隆載體pMD18-T-CD、pMD18-T-TK和pIRES分別經(jīng)雙酶切，成功構建了重組表達質粒pIRES-CD及pIRES-TK，并分別進行了菌落分析和酶切鑒定。將重組質粒pIRES-CD及pIRES-TK成功轉入ACC-2細胞，經(jīng)G418篩選后獲得穩(wěn)定表達CD、TK基因的ACC-2/CD-TK細胞，RT-PCR顯示長度為228bp及361bp的陽性條帶，證實目的基因已整合

10、到ACC-2細胞染色體DNA鏈中并轉錄表達，目的基因轉染對ACC-2細胞的形態(tài)及生長特性影響不大。 GCV對ACC-2/CD-TK細胞有明顯的細胞毒作用，而且具有劑量依賴性效應，當GCV濃度大于10-2ug/ml時，開始出現(xiàn)對ACC-2/CD-TK細胞生長的抑制；而在細胞濃度為102ug/ml時幾乎未見該細胞生長。根據(jù)量效關系計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)為3.11ug/ml，而未轉染ACC-2細胞的生長僅在GCV濃度達到102

11、ug/m1時才開始出現(xiàn)受到抑制，而且作用輕微，其IC50為225.5ug/ml，約為轉染后細胞IC50值的70倍，統(tǒng)計學分析二者差異有顯著意義(P＜0.01)；5-FC濃度為20ug/ml時開始出現(xiàn)對ACC-2/CD-TK細胞生長的抑制；而在細胞濃度為320ug/ml時幾乎未見該細胞生長，根據(jù)量效關系計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)為55.42ug/ml，而未轉染ACC-2細胞的生長僅在5-FC濃度達到160ug/ml時才開始出現(xiàn)受到抑制

12、，而且作用輕微，其IC50為265.56ug/ml，統(tǒng)計學分析二者差異有顯著意義(P＜0.01)。而聯(lián)合應用5-FC+GCV，其對應濃度下對細胞的殺傷效果明顯超過了單一應用GCV和5-FC。 不同混育比例和時間的細胞殺傷作用結果顯示，轉染細胞對GCV和5-FC的敏感性與混育比例的大小、混育時間有關。隨著ACC-2/CD-TK細胞比例的增大，其殺傷作用越明顯；同時，混育時間越長，其殺傷作用越明顯，說明逆轉錄病毒的轉染及基因的表達均

13、需要一定的時間，混育時間太短會影響其轉染的效果，進而影響其殺傷作用。 流式細胞儀結果顯示GCV及5-FC作用后，ACC-2/CD-TK細胞周期中DNA合成期(S期)比例升高，DNA合成前期及靜止期(G0/G1期)、DNA合成后期及分裂期(G2/M期)比例相應減少，細胞碎片增多，并出現(xiàn)明顯的Gl期前亞二倍體峰(即凋亡峰)：ACC-2細胞加藥后未見有明顯改變。 單一應用GCV時，當混合細胞中轉染細胞比例小于30﹪時，該效應并

14、不明顯，而比例超過30﹪時方出現(xiàn)明顯的旁觀者效應，隨著ACC-2/CD-TK細胞混育比例的增加，其效應逐漸加強，混育比例大于50﹪時才出現(xiàn)明顯的旁觀者效應；應用5-FC，混合細胞中轉染細胞比例為5﹪時即出現(xiàn)旁觀者效應，當混育比例超過50﹪后各組的細胞殺傷效果已無顯著差異(P＞0.05)；聯(lián)合應用時，在不同的混育細胞比例下均出現(xiàn)藥物協(xié)同作用，旁觀者效應明顯增加，當混合細胞中ACC-2/CD-TK細胞比例為10﹪時甚至出現(xiàn)顯著協(xié)同作用，當混

15、育比例大于30﹪后各組的細胞殺傷效果己無顯著差異(P＞0.05)。 結論1.成功克隆了大腸桿菌CD基因，并構建了克隆載體pMD18-T-CD，并對CD基因進行序列分析顯示，克隆的序列和文獻報道的基本一致。 2.在克隆載體pMD18-T-CD的基礎上成功構建了重組真核表達載體pIRES-CD，并進行了菌落分析和酶切鑒定。 3.成功克隆了HSV-TK基因，并構建了克隆載體pMD48-T-TK，并對TK基因進行序列分析

16、顯示，克隆的序列和文獻報道的基本一致。 4.在克隆載體pMD18-T-TK的基礎上成功構建了重組真核表達載體pIRES-TK，并進行了菌落分析和酶切鑒定。 5.應用電穿孔的方法成功將pIRES-CD、pIRES-TK轉染ACC-2細胞，并進行RT-PCR鑒定，獲得了預期的228bp和361bp的片段，表明了目的基因CD和TK己整合到ACC-2細胞染色體DNA鏈中，并進行有效的轉錄及表達。 6.應用CD-TK融合基

17、因治療時，HSV-TK/GCV體系對ACC-2/CD-TK細胞有明顯的劑量依賴性效應，但旁觀者效應并不突出；CD/5-FC體系也可產生劑量依賴性效應，但有明顯的旁觀者效應，從而彌補了HSV-TK/GCV體系的不足，明顯提高了CD-TK融合自殺基因的療效及應用價值。而且隨著ACC-2/CD-TK細胞比例的增大，其殺傷作用越明顯；同時，混育時間越長，其殺傷作用越明顯。 7.流式細胞儀結果顯示，應用CD-TK融合基因治療后，ACC-2