rAAV介導(dǎo)的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對乳腺癌細胞殺傷機理的初步研究.pdf

1、乳腺癌是人類常見的一種惡性腫瘤，也是女性主要惡性腫瘤之一。手術(shù)、放療、化療是目前腫瘤治療的主要手段。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因治療成為腫瘤治療的新模式。自殺基因療法是基因治療的策略之一，它通過轉(zhuǎn)基因的方法將哺乳動物不含有的藥物酶基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞內(nèi)，其表達產(chǎn)物可將無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為有毒性的代謝產(chǎn)物，影響細胞的生物合成，最終導(dǎo)致細胞死亡。本研究以人類乳腺癌細胞株MCF-7為實驗對象，利用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的含Tet-O

2、n調(diào)控元件的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對該細胞株進行殺傷性試驗，并利用基因芯片、RT-PCR、Western Blotting等手段對該系統(tǒng)對乳腺癌細胞殺傷作用的分子機理進行初步研究。本研究分為兩個部分： 第一章rAAV介導(dǎo)的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對乳腺癌細胞的殺傷作用。通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染pAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、pHelper、pAAV-RC三質(zhì)粒至病毒包裝細胞HEK293T，獲得了重組腺相關(guān)病毒rAAV/T

3、RE/Tet-On/HSVtk。經(jīng)純化后，以斑點雜交的方法檢測并計算得到所獲得的rAAV的病毒物理滴度為3.49×1011/ml。培養(yǎng)MCF-7細胞，以rAAV/TRE/Tet-On/HSVtk、Dox、GCV的不同組合處理該細胞。實驗分為rAAV+Dox+GCV組、rAAV+GCV組、rAAV+Dox組、rAAV組及陰性對照組。通過MTT試驗檢測藥物對細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)藥物處理細胞72h后，rAAV+Dox+GCV組的細胞相對其他各

4、組，細胞相對數(shù)量顯著減少（P<0.05）。以流式細胞術(shù)檢測HSVtk自殺基因系統(tǒng)處理MCF-7細胞后細胞周期的改變情況，發(fā)現(xiàn)rAAV+Dox+GCV組的細胞相對其他各組細胞，S期的細胞顯著增多（P<0.05），表明該系統(tǒng)干預(yù)乳腺癌細胞后，細胞周期S期受阻。 第二章rAAV介導(dǎo)的HSVtk自殺基因系統(tǒng)對乳腺癌細胞殺傷機理的初步研究。藥物處理乳腺癌細胞MCF-748 h后，提取細胞的總RNA，利用全基因芯片檢測藥物對該細胞內(nèi)基因表達

5、譜的影響。結(jié)果顯示，rAAV+Dox+GCV處理組細胞相對與其他各處理組細胞：上調(diào)基因246個，下調(diào)基因64個，其中與DNA復(fù)制、DNA損傷與修復(fù)相關(guān)的基因比較多，以及很多鋅指結(jié)構(gòu)蛋白。RT-PCR驗證了p21與PCNA在rAAV+Dox+GCV處理組與陰性對照組細胞之間的表達差異，結(jié)果顯示p21表達顯著上調(diào)，而PCNA表達顯著下調(diào)，與芯片結(jié)果一致。進一步利用Western Blotting研究藥物干預(yù)后相關(guān)蛋白質(zhì)p21、PCNA、CD

6、K1、Cyclin B、p53及磷酸化p53（Ser6）等蛋白的表達變化。結(jié)果顯示，相對于陰性對照組，rAAV+Dox+GCV處理組的p21蛋白表達量上調(diào)，而PCNA、CDK1、Cyclin B等蛋白表達量下調(diào)；而p53及磷酸化p53（Ser6）的表達在rAAV+Dox+GCV處理組與陰性對照組之間無顯著差異。因此我們推測，HSVtk自殺基因系統(tǒng)對乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用可能是通過一種非p53依賴性的途徑上調(diào)p21的表達，進而導(dǎo)致