MICA基因多態(tài)性與NK殺傷乳腺癌細胞的相關性研究.pdf

1、目的:探討MICA基因多態(tài)性與乳腺癌細胞對NK殺傷敏感度的關系。
　　方法:1.RT-PCR擴增乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-435S、SK-BR-3的MICA基因,分別克隆入pMD18-T載體,DNA測序分析。2.構建MICA不同等位基因真核表達載體并轉染293T細胞,westernblot和流式細胞術檢測轉染后MICA的表達。3.分離外周血單個核細胞,用“IL-2+IL-12+IL-15+IL-18

2、”細胞因子組合定向擴增NK細胞,再用VarioMACS系統(tǒng)分選純化NK細胞。4.LDH法檢測NK細胞對MICA等位基因轉染293T細胞的殺傷活性,Elispot法檢測MICA等位基因轉染293T后誘導NK細胞分泌穿孔素(perforin,PFN)、顆粒酶B(granzymB,GzmB)的能力。
　　結果:1.測序結果顯示:MCF-7細胞表達MICA*008/A5.1和MICA*001/A4,MDA-MB-435S細胞表達MICA*

3、010/A5,MDA-MB-231和SK-BR-3細胞均表達MICA*019/A5和MICA*002/A9;蛋白序列分析比對發(fā)現(xiàn):MICA*019/A5和MICA*010/A5僅在蛋白N端第29位氨基酸有差異,分別為精氨酸(Arginine,Arg)和脯氨酸(proline,Pro)。結構分析發(fā)現(xiàn)該Arg或Pro位點在蛋白結構的一個beta折疊上,而且是處于偏中間的位置。2.將MICA等位基因MICA*008/A5.1、MICA*001

4、/A4、MICA*019/A5、MICA*002/A9、MICA*010/A5分別克隆入pcDNA3.1/myc-His(-)A載體(重組載體分別命名為pMCFA5.1、pMCFA4、p231A5R、p231A9、p435A5P),重組載體轉染293T細胞后,westernblot檢測目的蛋白的表達,結果顯示:pMCFA5.1組表達最低,其次是p435A5P組,而pMCFA4組與p231A5R組、p231A9組表達較高;流式檢測細胞膜表

5、面目的蛋白的表達,結果顯示:p435A5P組表達最低,其次是pMCFA5.1組和MICA*001/A4組,而p231A5R組和p231A9組表達較高。3.外周血單個核細胞定向擴增NK細胞,培養(yǎng)17天后,NK細胞(CD3-CD56+)比例可達(72.1±2.9)％,NKG2D達(93.7±3.6)%;分選后NK細胞純度可達(95.2±3.0)%,NKG2D達(98.1±1.5)%。4.LDH檢測結果顯示:轉染了MICA基因的293T細胞對

6、NK細胞殺傷的敏感性明顯升高(P<0.05);在MICA轉染的293T中,p435A5P組對NK殺傷的敏感性最低(P<0.05);而pMCFA5.1、pMCFA4、p231A5R、p231A9各組之間相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Elispot檢測結果顯示:轉染了各種MICA基因的293T細胞能明顯誘導NK細胞釋放穿孔素和顆粒酶B(P<0.05);在MICA轉染的293T中,p435A5P組誘導NK細胞釋放穿孔素和顆粒酶B的能力最低