白血病ABCB1-P-gp啟動子甲基化分析及細胞間轉(zhuǎn)移機制和Nilotinib逆轉(zhuǎn)MDR作用及機制研究.pdf

1、目的：骨髓移植被認為是目前治療各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等最好的治療方法，然而，臨床上由于沒有足夠的合適的骨髓捐獻供者，化療仍是該部分患者唯一的治療選擇，不幸的是，臨床耐藥是成功化療的主要障礙。在過去30年，一系列多藥耐藥蛋白，例如ABCB1/P-gp、MRP1-9、ABCG2/BCRP、LRP被鑒定出與耐藥有關，其中ABCB1/P-gp，最重要的ABC家族膜蛋白成員之一，由MDR1(multidrugresist

2、ance1，MDR1)基因編碼，臨床發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤耐藥有關，P-gP作為藥物外排泵能夠降低細胞內(nèi)藥物累積，因此導致化療失敗。多項研究顯示ABCB1/P-gp的高表達與血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人預后相關。然而，這種化療后高表達和功能的改變以及其上調(diào)的精確機制目前仍不清楚。MDR1基因突變、易位以及與CD34的聯(lián)合表達可能導致MDR1基因的內(nèi)在表達。然而，功能的MDR1基因突變可能不是P-gp功能改變的主要因素。另一方面，化療藥物可引起P-gp

3、的高表達，DNA甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，可能存在于所有高等生物中，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。當細胞癌變時，某些抑癌和DNA修復基因的CpG島易出現(xiàn)過度甲基化，從而引起基因的沉默；另一方面，過低甲基化導致一些在正常情況下受到抑制的一些基因如癌基因，或相關因子得到大量表達，同時導致整個基因組

4、的不穩(wěn)定性增加。近來研究發(fā)現(xiàn)，MDR1肩動子區(qū)甲基化與腫瘤耐藥密切相關，這種異常甲基化導致轉(zhuǎn)錄因子更易與啟動子區(qū)結(jié)合，從而啟動轉(zhuǎn)錄，導致P-gp高表達而產(chǎn)生耐藥。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑DAC(5-Aza-cytidine)和組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑一曲古抑菌素TSA聯(lián)合應用能夠抑制細胞的增殖。
　　 各種分子生物學變化導致耐藥蛋白的上調(diào)從而引起化療耐藥，然而，這種變化并不能用來解釋為何敏感細胞和耐藥細胞混合培養(yǎng)，導致敏感細胞逃

5、避藥物細胞毒性最終導致化療耐藥，進而獲得多藥耐藥基因型(Aquired MDR)。幾項研究顯示，細胞能夠通過轉(zhuǎn)移膜蛋白進行通訊，從而導致瞬時轉(zhuǎn)移新的細胞膜蛋白至受體細胞。細胞與細胞之間的通訊在協(xié)調(diào)控制多元細胞系統(tǒng)中是必須的，多項研究集中在闡明神經(jīng)元突觸細胞間應答(在細胞間建立緊密連接)。最近，細胞間膜蛋白轉(zhuǎn)移研究主要集中在免疫反應細胞。在骨骼系統(tǒng)，研究顯示T細胞能夠轉(zhuǎn)移膜蛋白片段經(jīng)過一激活過程，從而改變了T細胞的功能，然而，血液系統(tǒng)中，

6、細胞處于懸浮狀態(tài)，這使通過轉(zhuǎn)移膜蛋白導致細胞間的交流比實體腫瘤細胞變得相對容易。更為重要的是P-gp是否能夠在血液系統(tǒng)細胞間發(fā)生轉(zhuǎn)移仍沒有人研究。
　　 逆轉(zhuǎn)MDR的策略主要集中在抑制或調(diào)控P-gp的活性。各種各樣的逆轉(zhuǎn)劑相繼被研究，有幾種已經(jīng)進入臨床試驗，不幸的是，沒有一個應用于臨床。我們先前研究發(fā)現(xiàn)幾種酪氨酸激酶抑制劑，如lapatinib(Tykerb，GW572016)，erlotinib(Tarceva，OSI-774

7、)，vandetanib(Zactima，ZD6474)，cediranib(recentin，AZD2171)，sunitinib(SUTENT，SU11248)能夠調(diào)控某種ATP-binding cassette(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白的功能，在幾種耐藥腫瘤細胞中能夠逆轉(zhuǎn)ABCB1/P-glycoprotein和/或ABCG2/BCRP介導的多藥耐藥。Nilotinib和dasatinib，第二代酪氨酸激酶抑制劑，靶點為BCR-ABL蛋白

8、ATP結(jié)合位點，對第一代藥物imatinib耐藥的病人同樣有效。然而兩種藥物對干細胞來源的表達CD34+，CD38-細胞都沒有效。幾項研究顯示，nilotinib不僅對野生型的BCR-ABL有效，其IC50小于30nM，而且對于imatinib耐藥的BCR-ABL32/33突變株亦有效。然而nilotinib和dasatinib是否具有以上提到的幾種酪氨酸激酶抑制劑類似效果目前沒有研究。
　　 本研究中，我們調(diào)查了228例血液系

9、統(tǒng)惡性腫瘤病人(90例健康對照)的多藥耐藥基因ABCB1/P-gp、ABCG2/BCRP、ABCC1/MRP1、ABCC4/MRP4的表達，分析了MDR1基因CpG島甲基化狀態(tài)與轉(zhuǎn)錄活性的關系，分析了MDR1基因啟動子低甲基化狀態(tài)、高表達與臨床預后的相關性。進而通過共聚焦和流式細胞分析方法評價了體內(nèi)外ABCB1/P-gp在耐藥細胞K562/A02與敏感細胞K562間的轉(zhuǎn)移，進而用Rh123和阿霉素累積實驗和MTT方法評價了轉(zhuǎn)移ABCB1

10、/P-gp蛋白的功能。最后調(diào)查了Nilotinib和Dasatinib在臨床幾種常見的耐藥蛋白過表達細胞和CD34+，CD38-病人細胞的逆轉(zhuǎn)作用及機制。
　　 方法：熒光定量PCR法檢測ABCB1/P-gp，ABCG2/BCRP，ABCC1/MRP1，ABCC4/MRP4的表達。流式細胞法檢測細胞膜蛋白的表達及羅丹明123和阿霉素累積。免疫印跡檢測蛋白表達。MSP PCR和亞硫酸氫鈉基因組測序分析MDR1基因啟動子甲基化。熒光

11、素酶報告系統(tǒng)分析相對熒光素酶活性。激光共聚焦分析P-gp細胞間的轉(zhuǎn)移。移植瘤實驗分析體內(nèi)P-gp細胞間轉(zhuǎn)移。細胞毒測定用MTT法；釩敏感法測定Nilotinib對ABCB1ATPase活性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴MDR1 mRNA的高表達與啟動子低甲基化高度相關，并且與預后相關，包括未移植病人2年生存率和移植病人完全緩解率。
　　 ⑵熒光素酶報告基因分析顯示，MDR1基因啟動子-50區(qū)相對熒光素酶活性甲基

12、化組比未甲基化組高。隨著5氮胞苷的處理時間增加，敏感細胞K562中MDR1mRNA表達逐漸上調(diào)。
　　 ⑶體內(nèi)外研究顯示，ABCB1/P-gp能夠從耐藥白血病細胞K562/A02轉(zhuǎn)移至鄰近敏感細胞。而且，MTT分析和阿霉素累積實驗顯示，P-gp能夠在混合培養(yǎng)裸鼠移植瘤內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移，并最終導致重要的耐藥基因型。
　　 ⑷P-gp細胞間轉(zhuǎn)移依賴于敏感細胞與耐藥細胞之間的比例。此外，轉(zhuǎn)移的P-gp能夠降低羅丹明123的累積。

13、r>　　 ⑸Nilotinib能夠顯著增加ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP過表達細胞和CD34+CD38-的白血病細胞的敏感性，增加其細胞內(nèi)的藥物濃度，對ABCC1/MRP1和ABCC4/MRP4介導的MDR則無明顯逆轉(zhuǎn)作用。
　　 ⑹Nilotinib不會改變ABCB1和ABCG2 mRNA和蛋白水平的表達。ATPase分析發(fā)現(xiàn)，nilotinib能夠增加ABCB1/P-gp的活性。
　　 ⑺Dasatin

14、ib不能增加ABCB1/P-gp，ABCG2/BCRP，ABCC1/MRP1和ABCC4/MRP4P過表達細胞的敏感性，也不能增加其細胞內(nèi)的藥物累積。
　　 結(jié)論：
　　 ①MDR1基因啟動子甲基化改變可能是化療后其mRNA轉(zhuǎn)錄水平表達上調(diào)的必要條件和重要原因，這種甲基化的異常可能導致啟動子區(qū)染色質(zhì)結(jié)構改變，影響轉(zhuǎn)錄因子SP1和EGF1的結(jié)合位點，導致表達上調(diào)。
　　 ②MDR1基因啟動子低甲基化和高表達與病人預

15、后高度相關：MDR1基因甲基化狀態(tài)與mRNA的表達呈負相關，未移植病人中低甲基化病人完全緩解率低，移植病人中出現(xiàn)高復發(fā)率。
　　 ③ABCB1/P-gp能夠在細胞間發(fā)生轉(zhuǎn)移，可能在白血病細胞介導獲得性耐藥起重要作用。
　　 ④ABCB1/P-gp細胞間轉(zhuǎn)移可能對保護敏感細胞逃避藥物細胞毒性，在化療過程中獲得一持續(xù)的耐藥基因型起到非常重要的作用。
　　 ⑤Nilotinib能夠逆轉(zhuǎn)ABCB1/P-gp和ABCG2/

16、BCRP介導的多藥耐藥，并且能夠增加CD34+，CD38-病人細胞的化療敏感性。對于指導臨床聯(lián)合用藥起重要作用。
　　 ⑥Nilotinib可能是ABCB1/P-gp的底物，可能通過抑制ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP藥物外排泵功能在體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)ABCB1/P-gp和ABCG2/BCRP介導的MDR。
　　 ⑦Dasatinib對ABCB1/P-gp，ABCG2/BCRP，ABCC1/MRP1和ABCC4/M