髓系白血病骨髓有核細(xì)胞中Wnt5a啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)及其與白血病發(fā)生關(guān)系的研究.pdf

1、目的:
　　 Wnt蛋白家族包括多個(gè)成員且序列和信號(hào)傳導(dǎo)方式高度保守,在調(diào)控胚胎發(fā)育中起重要作用,Wnt5a是其家族成員之一,該基因在各類腫瘤中的作用是近年關(guān)注的熱點(diǎn)之一。與Wnt5a相關(guān)的研究涉及多種腫瘤,并且在不同腫瘤中的表現(xiàn)不一。髓系白血病在中國(guó)的發(fā)病率持續(xù)升高,且國(guó)內(nèi)外罕見Wnt5a與髓系白血病關(guān)系的報(bào)道,我們前期研究已證明Wnt5a具有抑制白血病細(xì)胞株增殖的作用,其表達(dá)缺失可能與白血病發(fā)生有關(guān),但明確的作用機(jī)制尚未深入

2、研究。本研究擬觀察髓系白血病病人治療緩解前后骨髓有核細(xì)胞Wnt5a啟動(dòng)子甲基化水平的變化和去甲基化藥物對(duì)白血病細(xì)胞Wnt5a啟動(dòng)子甲基化水平的影響,進(jìn)一步探討它表達(dá)下調(diào)或沉默的機(jī)理以及與髓系白血病發(fā)生的關(guān)系,從而為白血病提供新的腫瘤診斷標(biāo)志物和基因治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.MSP法檢測(cè)30例急性髓細(xì)胞白血病初診病例和31例急性髓細(xì)胞白血病緩解病例骨髓有核細(xì)胞Wnt5a啟動(dòng)子甲基化水平。
　　 2.MSP

3、法檢測(cè)17例慢性粒細(xì)胞白血病慢性期病例標(biāo)本和3例急變期病例標(biāo)本W(wǎng)nt5a啟動(dòng)子甲基化水平。
　　 3.淋巴細(xì)胞分離液和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)分離培養(yǎng)髓系白血病原代細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞,并應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)2例培養(yǎng)的白血病原代細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Wnt5a的表達(dá)。
　　 4.MSP法檢測(cè)白血病原代細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Wnt5a啟動(dòng)子甲基化情況。
　　 5.MTT法檢測(cè)不同作用時(shí)間點(diǎn)和不同濃度去甲基化試劑Adc處理?xiàng)l件下的

4、各組U937細(xì)胞的增殖情況,并確定后期實(shí)驗(yàn)的最適藥物用量和作用時(shí)間。
　　 6.去甲基化試劑Adc處理U937白血病細(xì)胞株,檢測(cè)不同藥物濃度作用下Wnt5a的表達(dá)水平和Wnt5a基因啟動(dòng)子甲基化的水平的差異。
　　 7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)去甲基化試劑Adc處理U937細(xì)胞2d后細(xì)胞周期的變化情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.Wnt5a啟動(dòng)子甲基化情況:30例急性髓細(xì)胞白血病初診病例中22例出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象,啟動(dòng)子

5、甲基化率為73.3％(22/30);31例急性髓細(xì)胞白血病緩解病例中3例出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象,甲基化率為9.7％(3/31)。
　　 2.17例慢性粒細(xì)胞白血病慢性期病例標(biāo)本和3例急變期病例標(biāo)本中,Wnt5a啟動(dòng)子都未見甲基化。
　　 3.分離獲得懸浮生長(zhǎng)的白血病原代細(xì)胞和貼壁生長(zhǎng)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中,骨髓基質(zhì)細(xì)胞Wnt5a表達(dá)陽(yáng)性,而白血病原代細(xì)胞中未檢測(cè)到Wnt5a表達(dá)。
　　 4.骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Wnt5a啟動(dòng)子沒有發(fā)

6、生甲基化,而在白血病原代細(xì)胞中分別表現(xiàn)為部分甲基化和完全甲基化兩種情況。
　　 5.不同濃度去甲基化試劑Adc處理U937細(xì)胞不同時(shí)間,最終確定適用于U937細(xì)胞的Adc作用時(shí)間為48h,濃度范圍為3μmol/L～10μmol/L。
　　 6.Adc處理后U937細(xì)胞Wnt5a啟動(dòng)子甲基化水平下調(diào),mRNA表達(dá)恢復(fù),且在一定濃度范圍內(nèi),Wnt5a的表達(dá)量與Adc藥物濃度有關(guān)。
　　 7.與對(duì)照組細(xì)胞相比,Adc處

7、理后U937細(xì)胞G2期增高,表明Adc處理后,細(xì)胞周期被阻滯在G2期。
　　 結(jié)論:
　　 1.Wnt5a啟動(dòng)子甲基化現(xiàn)象在急性髓細(xì)胞白血病初診病例中陽(yáng)性率為73.3％,明顯高于緩解病例陽(yáng)性率9.7％,證實(shí)了我們前期研究發(fā)現(xiàn)白血病標(biāo)本中普遍存在Wnt5a表達(dá)缺失是因其啟動(dòng)子異常甲基化所致。
　　 2.治療緩解后Wnt5a啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)明顯下降,表明我們前期研究發(fā)現(xiàn)治療緩解病例Wnt5a表達(dá)恢復(fù)的原因是經(jīng)治療去除

8、了其啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。研究結(jié)果提示W(wǎng)nt5a啟動(dòng)子的異常甲基化可能與白血病細(xì)胞的惡性增殖有關(guān),Wnt5a表達(dá)水平變化和啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)可能成為判斷病情發(fā)展和預(yù)后的實(shí)驗(yàn)室診斷新指標(biāo)。
　　 3.慢性期和急變期的慢粒病人骨髓有核細(xì)胞Wnt5a啟動(dòng)子均未見甲基化現(xiàn)象。前期研究中Wnt5a在慢粒病人和K562細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá),在mRNA水平上與在急性髓系白血病中極為類似;但啟動(dòng)子甲基化研究提示W(wǎng)nt5a在慢粒病人中表達(dá)下調(diào)原因不同

9、于急性髓細(xì)胞白血病,可能受其他機(jī)制調(diào)節(jié),有待進(jìn)一步研究。
　　 4.白血病病人的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Wnt5a高表達(dá),且啟動(dòng)子未見甲基化,而白血病腫瘤細(xì)胞Wnt5a低表達(dá)且啟動(dòng)子發(fā)生明顯甲基化,說明白血病病人骨髓中的基質(zhì)細(xì)胞可能未發(fā)生異常,Wnt5a啟動(dòng)子甲基化可能特異的出現(xiàn)在白血病細(xì)胞等惡性細(xì)胞中,是急性髓細(xì)胞白血病中Wnt5a低表達(dá)的主要原因。
　　 5.去甲基化試劑Adc作用后,白血病細(xì)胞U937增殖能力減低,提示W(wǎng)nt

10、5a的表達(dá)可能抑制白血病細(xì)胞增殖。
　　 6.Adc處理后,Wnt5a表達(dá)恢復(fù),U937細(xì)胞G2期增高,提示W(wǎng)nt5a可能將細(xì)胞周期阻滯在G2期,細(xì)胞不能進(jìn)行有絲分裂,從而抑制了細(xì)胞的增殖,但去甲基化試劑不能完全改變U937細(xì)胞Wnt5a啟動(dòng)子異常甲基化情況,說明仍有其他機(jī)制維持白血病細(xì)胞的異常甲基化,其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。
　　 以上研究提示,Wnt5a啟動(dòng)子甲基化水平在急性髓細(xì)胞白血病病例中普遍升高,而在治療緩解