采用基因芯片技術篩選急性髓系白血病細胞中的甲基化沉默基因.pdf

1、背景與目的：白血病是由細胞增殖和分化成熟失衡所引起一種常見的造血系統(tǒng)惡性疾病，其發(fā)生發(fā)展是多因素參與、多步驟的復雜過程，涉及遺傳學和表觀遺傳學改變。DNA甲基化是基因表達調控最常見的表觀遺傳學機制之一，異常甲基化基因不僅在白血病發(fā)病中起著重要作用，而且可能是白血病的特異性治療靶標。因此，篩選新的白血病甲基化沉默基因，將有助于揭示白血病的發(fā)病機制，為白血病的防治提供重要的理論依據和科學基礎。 方法：以急性髓系白血病(acute m

2、yelogenous leukemia，AML)細胞系HL-60為對象，應用甲基轉移酶抑制劑5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，5-aza-2dC)處理HL-60細胞，采用MTT比色試驗、流式細胞術、瑞氏染色及Hochest33342染色觀察5-aza-2dC對HL-60細胞的生長，細胞周期，分化及凋亡的影響；采用人類全基因組U133+2.0芯片比較5-aza-2dC處HL-60細胞前后基因表達譜的變

3、化，采用RT-PCR法驗證基因芯片的結果，MSP法檢測基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化情況，篩選AML細胞中的甲基化沉默基因。 結果：1.5-aza-2dC呈劑量和時間依賴性地抑制HL-60細胞的生長，阻滯HL-60細胞于G2/M期，誘導HL-60細胞凋亡，并增強HL-60細胞的髓系分化抗原CD11b的表達，促進HL-60細胞向成熟粒細胞分化。5-aza-2dC在低濃度(0.5 μmol/L)時促分化作用最明顯，而在高濃度(5.0

4、μmol/L)時誘導凋亡的作用最明顯；2.采用基因芯片技術篩選到117個差異表達基因，其中109個基因在5-aza-2dC處理后表達上調，8個表達下調，差異基因的功能涉及細胞增殖、細胞凋亡、細胞周期、Toll樣受體信號通路和組氨酸代謝通路等；3.采用RT-PCR法檢測12個表達上調基因(ANXA2，CTNND1，S100A9，S100A8，NQ01，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1，THBS1，BCSC1)在5-

5、aza-2dC處理HL-60細胞前后的表達水平，結果與基因芯片分析結果一致；4。采用MSP法檢測8個經過表達驗證了的基因(ANXA2，CTNND1，GLIPR1，EPAS1，PRF1，H19，PHLDA1，THBS1)啟動子的甲基化情況，結果顯示經5-aza-2dC處理后，其啟動子非甲基化水平上調，而甲基化水平下調，提示這8個基因為HL-60細胞中的甲基化沉默基因。 結論：1.甲基化轉移酶抑制劑5-aza-2dC能抑制急性髓系白

6、血病細胞HL-60的生長，阻滯HL-60細胞于G2/M期，并能促進HL-60細胞分化和誘導其凋亡，這些作用可能與5-aza-2dC抗急性髓系白血病作用有關；2.采用基因芯片技術比較了甲基化轉移酶抑制劑5-aza-2dC處理HL-60細胞與對照細胞的基因組表達譜差異，篩選到117個差異基因，其中109個表達上調，8個表達下調。3.采用基因芯片與MSP檢測技術相結合的方法篩選HL-60細胞中的甲基化沉默基因，發(fā)現并初步證實了HL-60細胞中