急性白血病細(xì)胞中SOCS-1和SHP-1基因的甲基化及其意義.pdf

1、目的:近年來的研究表明DNA的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子SOCS-1和造血細(xì)胞磷酸酶SHP-1已被研究認(rèn)為是白血病和其他腫瘤中的候選抑癌基因,在白血病細(xì)胞中同樣存在甲基化現(xiàn)象,而導(dǎo)致其正常表達(dá)下調(diào)或缺失。本研究通過檢測白血病細(xì)胞中SOCS-1和SHP-1基因甲基化狀態(tài)以及甲基化抑制劑處理前后相關(guān)基因的甲基化狀態(tài)和表達(dá)水平,以進(jìn)一步探討它們在急性白血病發(fā)病中的作用機(jī)制,為白血病的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。<

2、br>　　 方法:研究對象為80例急性白血病(AL)患者(包括初治緩解及復(fù)發(fā)),30例正常對照,及白血病細(xì)胞株U937和HL60。
　　 1采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(simi-quantify reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)和熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescent quantitative polymerase c

3、hain reaction,FQ-PCR)方法檢測AL患者、正常對照的骨髓單個核細(xì)胞的SHP-1、SOCS-1mRNA表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)水平。
　　 2將人白血病細(xì)胞株HL60和U937分別培養(yǎng)于含13％滅活小牛血清(FBS)、100U/ml的青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中,置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2-3天傳代1次,取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。用MTT及AnnexinV/PI法

4、測定經(jīng)不同濃度甲基化抑制劑5-氮雜脫氧胞苷(5-aza-CdR)干預(yù)后的HL60和U937的細(xì)胞增殖凋亡情況。
　　 3應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(methylation-specific polymerase chainreaction,MSP)檢測AL患者,正常對照及不同濃度甲基化抑制5-aza-CdR干預(yù)前后的人白血病細(xì)胞株HL60和U937細(xì)胞SHP-1、SOCS-1的甲基化狀態(tài)。
　　 結(jié)果:
　　

5、1 SOCS-1mRNA在各組中的表達(dá):正常對照組的陽性表達(dá)率為100％(30/30),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為0.826;初治組的陽性表達(dá)率為42％(20/48),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為0.337,其表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P=0.00＜0.05);緩解組的陽性表達(dá)率為92％(24/26),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為0.765,與正常對照組相比無顯著性差異(P=0.89＞0.05);復(fù)發(fā)組陽性表達(dá)率為50％(3/6),基因相對表達(dá)

6、水平中位數(shù)為0.323,其表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P=0.00＜0.05)。
　　 2 SHP-1mRNA在各組中的表達(dá):SHP-1mRNA正常對照組的陽性表達(dá)率為100％(30/30),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為1.964;初治組的陽性表達(dá)率為45％(22/48),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為0.166,其表達(dá)水平明顯低于正常對照組(JP=0.00＜0.05);緩解組的陽性表達(dá)率為89％(23/26),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為0

7、.845,同正常對照組相比無顯著性差異(P=1.22＞0.05);復(fù)發(fā)組陽性表達(dá)率為50％(3/6),基因相對表達(dá)水平中位數(shù)為0.255,其表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P=0.00＜0.05)。
　　 3隨著5-aza-CdR濃度的增加,白血病細(xì)胞HL60、U937存活率呈明顯下降趨勢,其中10.0和20.0μmol/L組存活率分別為:HL60為62％和40％:U937為60％和36％。固定5-aza-CdR濃度為IC50值,隨

8、著作用時間的延長,白血病細(xì)胞存活率呈明顯下降。
　　 4在處理前,原代細(xì)胞SHP-1基因處于完全甲基化狀態(tài);在5-aza-CdR處理后,隨著藥物濃度的遞增,SHP-1基因由完全甲基化逐漸變?yōu)椴糠旨谆?在10.0和20.0μmol/L濃度組,SHP-1基因甚至變?yōu)槲醇谆癄顟B(tài)。
　　 5 SOCS-1 DNA甲基化在80例白血病患者中有66例(83％)表達(dá),其中初治組46例(96％),緩解組15例(58％),復(fù)發(fā)組5例(

9、83％),而在正常對照中未發(fā)現(xiàn)SOCS-1基因的CpG島甲基化。
　　 6 SHP-1 DNA甲基化在80例白血病患者中有57例(71％)表達(dá),其中初治組43例(90％),緩解組10例(38％),復(fù)發(fā)組4例(67％),在正常對照中未發(fā)現(xiàn)SOCS-1基因的CpG島甲基化。
　　 結(jié)論:
　　 1 SOCS-1和SHP-1基因在初治AL患者低表達(dá),緩解后表達(dá)升高,復(fù)發(fā)時再度降低,表明與白血病的預(yù)后有關(guān),可作為判斷療效

10、預(yù)后的指標(biāo)之一。
　　 2白血病細(xì)胞中存在SOCS-1和SHP-1DNA的高甲基化,而在正常對照中沒有,因此甲基化可能是白血病細(xì)胞SOCS-1和SHP-1低表達(dá)的原因,很可能是白血病發(fā)生的一個重要因素。
　　 35-aza-CdR對白血病細(xì)胞株HL60和U937的增殖凋亡均有明顯抑制作用,并且隨著濃度增大及作用時間的延長SOCS-1和SHP-1基因DNA甲基化程度逐漸降低直至消失,呈濃度和時間依賴性。因此,SOCS-1和