As2O3對(duì)急性白血病細(xì)胞系Dickkopf1(DKK--1)基因的去甲基化實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Dickkopf(DKKs)是一種分泌型糖蛋白,作為經(jīng)典WNT/β-catenin通路的關(guān)鍵抑制因子,在胚胎細(xì)胞的定向分化中發(fā)揮重要作用,是當(dāng)今腫瘤分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn)。經(jīng)典WNT/v-catenin通路的異常激活可直接或間接導(dǎo)致白血病等多種腫瘤發(fā)生。Dickkopfl(DKK-1)是新近發(fā)現(xiàn)的DKKs家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn),DNA的異常甲基化是引起DKK-1基因表達(dá)沉寂的重要方式之一。因此,針對(duì)DKK-1基因的去甲基化治療成為急性白血

2、病(acute leukemia,AL)防治的一條新思路。本課題為此進(jìn)行該方向的實(shí)驗(yàn)研究。
　　我國(guó)學(xué)者研究表明,三氧化二砷(As2O3)對(duì)部分腫瘤細(xì)胞具有下調(diào)端粒酶活性、抗血管新生、誘導(dǎo)凋亡和分化等作用。然而,由于其代謝過(guò)程中需要通過(guò)甲基化被解毒,砷劑有可能在體內(nèi)通過(guò)對(duì)甲基產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用,從而干擾基因組DNA甲基化模式。由此,本課題選用As2O3作為去甲基實(shí)驗(yàn)藥物,對(duì)DKK-1基因高甲基化的AL細(xì)胞系進(jìn)行去甲基作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。

3、探討DKK-1基因甲基化模式改變可能的機(jī)制及其與AL發(fā)病的關(guān)系；為完善As2O3在AL的治療中發(fā)揮的作用機(jī)制提供理論與實(shí)驗(yàn)證據(jù),進(jìn)一步拓寬惡性血液病治療策略上的思路。
　　本課題研究主要包括3個(gè)方面：
　　1、β-catenin在急性白血病細(xì)胞系中表達(dá)的研究：采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)與流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)β-catenin在4種AL細(xì)胞系(NB4.Jurkat. Molt-4、CEM)中的表達(dá)。PCR結(jié)果表明

4、,與正常對(duì)照組相比,4種AL細(xì)胞系中β-catenin在轉(zhuǎn)錄水平上有廣泛表達(dá)。流式結(jié)果顯示,在4種AL細(xì)胞系中β-catenin胞內(nèi)蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度MFI與對(duì)照組相比均升高(P0.05)。
　　2.Dickkopfl(DKK-1)基因甲基化在急性白血病中的表達(dá)分析：采用RT-PCR方法檢測(cè)4個(gè)AL細(xì)胞系及對(duì)照組中DKK-1基因mRNA的表達(dá)情況；采用甲基化特異性PCR(MSP)方法檢測(cè)對(duì)照組及4個(gè)細(xì)胞系中DK

5、K-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明：與正常對(duì)照組比較,AL細(xì)胞系中DKK-1基因mRNA表達(dá)量顯著降低(P0.05)；正常對(duì)照組標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞中不存在DKK-1基因的甲基化；所檢測(cè)的細(xì)胞系中均可見(jiàn)DKK-1基因呈甲基化或部分甲基化狀態(tài)。
　　3、As203對(duì)WNT/β-catenin通路抑制因子DKK-1基因甲基化的影響：采用8umol/L As2O3培養(yǎng)4個(gè)AL細(xì)胞系24h后,以MSP方法檢測(cè)各細(xì)胞系DKK-1基因甲基化

6、狀態(tài),以RT-PCR與Western Blot技術(shù)檢測(cè)DKK-1mRNA與蛋白表達(dá)變化,以流式細(xì)胞術(shù)檢4個(gè)AL細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)。結(jié)果表明,用藥24h后,DKK-1基因甲基化程度明顯減低至消失,其mRNA與蛋白部分或完全恢復(fù)表達(dá)。β-catenin的陽(yáng)性細(xì)胞百分比和平均熒光強(qiáng)度與加藥前相比均降低(P0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、作為WNT/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的“調(diào)節(jié)子”,β-catenin