白血病Hedgehog信號(hào)通路激活與HHIP基因甲基化的關(guān)系及As2O3去甲基化機(jī)制研究.pdf

1、白血病的病因及發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前還不完全清楚。表觀遺傳學(xué)調(diào)控是基于非基因序列改變所致可遺傳的基因表達(dá)水平變化的一種調(diào)控方式，包括DNA甲基化、組蛋白去乙?；?、小RNA(miRNA)沉默等，表觀遺傳調(diào)控導(dǎo)致的抑癌基因表達(dá)沉默是誘發(fā)白血病的重要因素之一，近年研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化是人類白血病中普遍存在的現(xiàn)象，與白血病的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 抑癌基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活是一個(gè)可逆的表觀遺傳學(xué)修飾過程，恢復(fù)或改變基因的高甲基化狀

2、態(tài)，從而改變基因組表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的功能狀態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)，是去甲基化治療的理論基礎(chǔ)。去甲基化治療作為一種新的抗腫瘤方法已在白血病及骨髓增生異常綜合征(MDS)的治療中展示了良好的應(yīng)用前景，特別是為難治復(fù)發(fā)白血病的治療開辟了一條新的途徑。目前臨床上常用的去甲基化藥物是5－氮雜－2’－脫氧胞苷(5－aza－2'deoxyeytidine，地西他濱)等。三氧化二砷(As2O3)是一種傳統(tǒng)中藥，最初用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)并取得良好效果，

3、As2O3治療APL的主要機(jī)制與誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的凋亡有關(guān)，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)砷劑對(duì)其他類型白血病細(xì)胞株及實(shí)體腫瘤細(xì)胞亦具有廣泛的抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡的作用。最近又有不可思議的新發(fā)現(xiàn)，As2O3可逆轉(zhuǎn)骨髓瘤細(xì)胞及淋巴瘤細(xì)胞中某些抑癌基因的高甲基化狀態(tài)，也就是說As2O3還具有去甲基化作用。As2O3對(duì)白血病細(xì)胞除誘導(dǎo)凋亡外，是否還有其他作用機(jī)制?As2O3對(duì)白血病發(fā)病過程中起重要作用的抑癌基因是否也有去甲基化作用?目前尚未見報(bào)道。

4、　　 Hedgehog(Hh)信號(hào)通路是體內(nèi)重要信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，它在人類和動(dòng)物的正常胚胎發(fā)育和器官形成過程中發(fā)揮重要作用，但相對(duì)于WNT、NOTCH等其他信號(hào)通路，該通路的研究較少，也不夠深入。通常情況下，該信號(hào)通路在機(jī)體發(fā)育成熟后進(jìn)入失活狀態(tài)，但其通路成員的突變或錯(cuò)誤表達(dá)會(huì)激活該通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Hh通路的異常激活，但其激活的具體機(jī)制尚不明確。在Hh通路被激活的腫瘤中，HHh激活的機(jī)制也是不同的，部

5、分是由于Hh信號(hào)通路某個(gè)成員的突變，但約有一半并沒有發(fā)現(xiàn)通路成員的突變，因而推測Hh通路的激活還有其他調(diào)控機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)肝癌、腦膜瘤等實(shí)體瘤中存在Hh信號(hào)通路成員HHIP啟動(dòng)子甲基化現(xiàn)象，提示表觀遺傳學(xué)可能參與了Hh通路的調(diào)控。
　　 為進(jìn)一步探討Hh信號(hào)通路在白血病中的作用及激活的機(jī)制，Hh通路抑制因子HHIP的甲基化是否也參與了Hh通路的激活及白血病的發(fā)生，我們從RNA水平及蛋白水平上對(duì)As2O3處理前后該通路成員進(jìn)行了檢測

6、，用甲基化特異性PCR檢測Hh通路抑癌基因HHIP的甲基化狀態(tài)，對(duì)進(jìn)一步闡明白血病發(fā)病機(jī)制的未知領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)有重要意義。
　　 目的：
　　 一、分別從mRNA水平及蛋白水平檢測Hh信號(hào)通路成員及靶基因Gli、PTCH表達(dá)，了解白血病細(xì)胞系Hh通路的活性水平。
　　 二、用甲基化特異性PCR檢測白血病細(xì)胞系Hh通路抑制因子HHIP的甲基化狀態(tài)，并探討HHIP的高甲基化是否與Hh通路的異常激活有關(guān)。

7、>　　 三、觀察三氧化二砷(As2O3)能否通過逆轉(zhuǎn)HHIP基因甲基化而阻斷Hh異常激活，從而明確Hh通路是否存在去甲基化藥物的作用靶點(diǎn)。
　　 四、探討As2O3去甲基化作用的最佳濃度及具體機(jī)制。
　　 方法：
　　 選用急性髓系白血病細(xì)胞系HL60、慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562、急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系BALL-1、急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat作為研究對(duì)象，對(duì)照組為正常人外周血淋巴細(xì)胞。細(xì)胞株

8、用含10％小牛血清的RPM I1640培養(yǎng)液、在37℃和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。
　　 一、白血病細(xì)胞系Hh通路的活性水平
　　 1、RT-PCR檢測SHH、PTCH、Gli、HHIP基因mRNA表達(dá)
　　 用Total RNA提取試劑RNAiso提取細(xì)胞系總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各白血病細(xì)胞系及正常人外周血淋巴細(xì)胞Hedgehog通路成員SHH、PTCH、Gli、HHIP基因mRN

9、A表達(dá)。
　　 2、Western-blot檢測Hh通路成員蛋白表達(dá)水平
　　 采用蛋白裂解液提取蛋白，SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，加一抗和酶標(biāo)的山羊抗兔的IgG，最后加底物顯色5min，暗室發(fā)光并顯影定影。使用凝膠分析系統(tǒng)測定條帶的面積和灰度值，以積分灰度值與內(nèi)參的比值代表蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　 二、白血病細(xì)胞HHIP基因甲基化狀態(tài)檢測及對(duì)Gli表達(dá)的影響
　　

10、 1、采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)檢測4種白血病細(xì)胞系及正常人外周血淋巴細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路HHIP基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況。
　　 2、用siRNA技術(shù)封閉HHIP基因表達(dá)，然后用RT-PCR檢測Gli表達(dá)變化，進(jìn)一步驗(yàn)證HHIP基因?qū)li的調(diào)控作用。
　　 三、As2O3去甲基化作用機(jī)制研究
　　 用不同濃度的As2O3處理BALL-1細(xì)胞系，按照As2O3濃度分為0、2.5、5.0、1

11、0.0 umol/L組，藥后常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程不換液。
　　 1、CCK-8檢測細(xì)胞增殖
　　 于藥物處理后24、48、72、96小時(shí)加入10ul CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2-3小時(shí)，置酶標(biāo)儀上450nm單波長測吸光度OD值，計(jì)算抑制率，并以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制生長曲線。
　　 2、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期變化
　　 As2O3處理48小時(shí)后，收集各組細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測As2O3處理后細(xì)胞周

12、期變化。
　　 3、As2O3對(duì)BALL-1細(xì)胞HHIP基因甲基化模式的影響
　　 As2O3對(duì)BALL-1細(xì)胞作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，提取細(xì)胞基因組DNA，采用CpGenome DNA Methylation kit試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行修飾，然后用MS-PCR檢測BALL-1細(xì)胞系HHIP基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況。
　　 4、As2O3對(duì)BALL-1細(xì)胞HHIP基因及Hh通路靶基因Gli、下游基因cy

13、clinD2表達(dá)的影響
　　 As2O3作用于BALL-1細(xì)胞48小時(shí)后，用Total RNA提取試劑RNAiso提取BALL-1細(xì)胞系總RNA，用RT-PCR檢測HHIP、Gli、cyclinD2基因mRNA表達(dá)。用Western-blot檢測藥物處理后HHIP蛋白表達(dá)。
　　 5、As2O3對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶dnmt1、dnmt3b mRNA及去甲基化酶mbd2 mRNA表達(dá)的影響
　　 As2O3作用于BA

14、LL-1細(xì)胞48小時(shí)后，用Total RNA提取試劑RNAiso提取BALL-1細(xì)胞系總RNA，用RT-PCR檢測dnmt1、dnmt3b、mbd2 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 一、白血病細(xì)胞Hh通路的活性水平
　　 PTCH、Gli既是Hh信號(hào)通路的成員，也是該通路的靶基因，通常用PTCH、Gli表達(dá)來代表Hh通路的活性。
　　 4種白血病細(xì)胞系中，BALL-1、Jurkat細(xì)胞系Gli mRN

15、A表達(dá)均明顯高于對(duì)照組(1.163±0.066 vs0.828±0.067，1.123±0.024 vs0.828±0.067，P<0.05)；HL60細(xì)胞PTCH表達(dá)高于對(duì)照組(0.783±0.045 vs0.553±0.064，P<0.05)，所有白血病細(xì)胞系中SHH配體表達(dá)與正常人淋巴細(xì)胞相比，無明顯差異(P>0.05)；除K562細(xì)胞系外，HL60(0.638±0.130 vs0.744±0.061)、BALL-1(0.416±

16、0.064 vs0.744±0.061)、Jurkat(0.544±0.098 vs0.744±0.061中HHIP表達(dá)都明顯減低(P<0.05)。BALL-1細(xì)胞Gli蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(1.223±0.102 vs0.830±0.046，P<0.05)，以上結(jié)果提示在BALL-1、Jurkat、HL60細(xì)胞中，Hh通路是激活的。
　　 二、HHIP基因的MS-PCR檢測結(jié)果及HHIP甲基化對(duì)Gli表達(dá)的影響
　　 1

17、、在4種白血病細(xì)胞系中檢測到HHIP發(fā)生不同程度甲基化，其中BALL-1、Jurkat中HHIP基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高甲基化，HL60、K562細(xì)胞HHIP基因檢測到部分甲基化，而正常人淋巴細(xì)胞HHIP基因未發(fā)生甲基化。
　　 2、HHIPsiRNA孵育BALL細(xì)胞48h后，HHIP的mRNA轉(zhuǎn)錄受抑制，電泳條帶變暗，HHIP/GAPDH從0.983降至0.409；Gli1mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高，條帶變亮，Gli/GAPDH從1

18、.045增至1.383，提示在BALL細(xì)胞中HHIP可能Gli的上游負(fù)性調(diào)控因子，可抑制Gli的轉(zhuǎn)錄。
　　 三、As2O3去甲基化機(jī)制研究
　　 1、As2O3對(duì)BALL-1細(xì)胞生長的抑制作用
　　 各藥物處理組的細(xì)胞增殖抑制率隨時(shí)間和濃度增加而顯著升高，與陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其抑制率呈時(shí)間和濃度依賴性。
　　 2、As2O3對(duì)細(xì)胞周期的影響
　　 不同濃度As2O3

19、處理后，BALL-1細(xì)胞不同程度阻滯于G0、G1期，G0/G1期細(xì)胞百分比升高，S、G2/M期百分比下降(P<0.05)。提示As2O3能引起B(yǎng)ALL-1細(xì)胞的G0/G1期停滯，從而抑制細(xì)胞增殖。
　　 3、As2O3對(duì)HHIP基因甲基化模式的影響
　　 未加藥組細(xì)胞HHIP-M擴(kuò)增結(jié)果陽性，HHIP-U擴(kuò)增結(jié)果為陰性，提示BALL-1細(xì)胞常態(tài)下HHIP基因呈高度甲基化；隨著As2O3濃度的升高，HHIP-M條帶逐漸減弱

20、，而HHIP-U條帶逐漸增強(qiáng)，提示BALL-1細(xì)胞HHIP基因甲基化程度逐漸降低，而非甲基化程度逐漸升高。以上結(jié)果表明：As2O3可逆轉(zhuǎn)HHIP基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化狀態(tài)，且呈濃度依賴性。
　　 4、As2O3對(duì)HHIP基因及Hh通路靶基因Gli、下游基因cyclinD表達(dá)的影響
　　 5.0umol/L As2O3處理BALL-1細(xì)胞72小時(shí)后，HHIP mRNA及蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(0.826±0.045 vs0.25

21、3±0.012，0.328±0.021 vs0.024±0.005，P<0.05)。說明5.0umol/L以上濃度As2O3對(duì)BALL-1細(xì)胞有去甲基化作用。Hh通路靶基因Gli mRNA表達(dá)較藥物處理前減低(1.030±0.088 vs1.328±0.071 P<0.05)。而下游基因cyclinDmRNA表達(dá)在藥物處理前后無明顯差異(P>0.05)。
　　 5、As2O3對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶及去甲基化酶表達(dá)的影響
　　

22、 未加藥組BALL-1細(xì)胞dnmt1、dnmt3b基因呈強(qiáng)表達(dá)；加藥組隨As2O3濃度的增加，dnmt1、dnmt3b基因的表達(dá)逐漸減弱，與未加藥組差異有顯著性(0.548±0.044 vs0.886±0.028，0.463±0.043 vs0.877±0.039，P<0.05)。As2O3處理前后mbd2 mRNA的表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。提示As2O3可下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶dnmt1、dnmt3bmRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮去甲

23、基化作用。
　　 結(jié)論：
　　 一、BALL-1、Jurkat、HL60細(xì)胞系Gli或PTCH表達(dá)增加，Hedgehog信號(hào)通路異常激活，提示白血病發(fā)生可能與Hedgehog信號(hào)通路的異常激活有關(guān)。
　　 二、HHIP基因啟動(dòng)子甲基化使HHIP基因沉默，失去對(duì)Hh通路的調(diào)控作用，可能是Hedgehog信號(hào)通路的異常激活的機(jī)制之一。
　　 三、As2O3對(duì)BALL-1細(xì)胞HHIP基因有去甲基化作用，且呈濃度