特定基因甲基化研究方法建立及LEAFY基因甲基化與早實(shí)枳階段發(fā)育關(guān)系研究.pdf

1、果樹大多為多年生木本植物,從種子播種至首次開花結(jié)實(shí)要經(jīng)歷漫長的童期。童期的最基本特征是實(shí)生苗不具備開花能力。多年生木本植物由于個(gè)體體積大、童期長、遺傳背景復(fù)雜等特點(diǎn),極大地阻礙了木本植物,特別是一些以收獲果實(shí)、花和種子為主的果樹和經(jīng)濟(jì)林木的遺傳學(xué)研究、育種進(jìn)程和新品種推廣。因此,研究木本植物成花分子機(jī)理、提早和調(diào)控果樹成花成為果樹學(xué)研究中的一個(gè)重要課題。早實(shí)枳為普通枳的一個(gè)實(shí)生變異,童期僅1-2年,與普通枳相比大大縮短,為木本植物童期發(fā)

2、育研究提供了極好的材料。
　　 果樹成花研究,早期主要集中于生理生化基礎(chǔ),環(huán)境因子和栽培技術(shù)措施對(duì)實(shí)生苗成花的影響,對(duì)于果樹開花的分子機(jī)制及其遺傳控制的研究較少,在果樹成花的表觀遺傳學(xué)研究方面也鮮有報(bào)道。DNA的甲基化是真核生物的表觀遺傳調(diào)控的重要途徑。建立植物基因甲基化研究方法、開展相關(guān)基因在階段發(fā)育進(jìn)程中甲基化與去甲基化的變化與發(fā)育進(jìn)程的關(guān)系研究,有助于我們進(jìn)一步揭示植物發(fā)育表觀調(diào)控的機(jī)制,為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)縮短童期和花期調(diào)控打下

3、基礎(chǔ)。
　　 本研究通過不同濃度的5-AzaC對(duì)早實(shí)枳種子進(jìn)行去甲基化處理,觀察植株生長狀況,分析LFY,TFL等成花相關(guān)基因表達(dá)量變化,采用生物信息學(xué)方法對(duì)這些成花相關(guān)基因進(jìn)行了甲基化區(qū)域掃描,針對(duì)有CpG島的LFY基因,以亞硫氫酸鈉修飾測(cè)序的方法對(duì)不同發(fā)育時(shí)期早實(shí)枳幼葉中LFY基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行了比較。主要結(jié)果如下:
　　 1.通過0、250、500、1000μM濃度的5-AzaC對(duì)培養(yǎng)皿中對(duì)早實(shí)枳種子連續(xù)處理15天

4、后,觀察發(fā)現(xiàn)隨著5-AzaC濃度的加大,種子的生長發(fā)育減緩,根的發(fā)育顯著被抑制。處理15天后的早實(shí)枳種子實(shí)生苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中生長20天以后觀察,發(fā)現(xiàn)250μM5-AzaC處理的種子的根和莖的發(fā)育均有所減緩,部分葉的發(fā)育出現(xiàn)畸形；而500μM5-AzaC處理后種子的根,莖,葉的生長都出現(xiàn)明顯的抑制,并表現(xiàn)畸形；1000μM5-AzaC處理的種子和20天前相比較幾乎沒有生長,生長被完全抑制。
　　 2.從5-AzaC處理的早實(shí)枳葉片中

5、提取RNA,用Real-time PCR方法分析了5個(gè)成花相關(guān)基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)除FT相對(duì)表達(dá)量是隨著5-AzaC處理濃度的增加而逐漸增加外,TFL,LFY,AP1、FLC四個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量都在250μM濃度時(shí)達(dá)到最大,處理濃度繼續(xù)升高,基因的相對(duì)表達(dá)量下降。表明去甲基化處理對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有影響,大多數(shù)基因在低濃度去甲基化處理下,轉(zhuǎn)錄水平提高,而高濃度去甲基化會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平下降。
　　 3.使用Methyl Primer

6、Express和EMBOSS CpG Plot Tool軟件,依照新舊兩種CpG島的定義,對(duì)早實(shí)枳中分離得到的5個(gè)成花相關(guān)基因TFL、LFY、AP1、FLC、刀的基因及啟動(dòng)子序列進(jìn)行甲基化相關(guān)的生物信息學(xué)分析,然而僅預(yù)測(cè)到LFY序列中存在CpG島。
　　 4.借鑒醫(yī)學(xué)研究中的亞硫氫酸鈉修飾測(cè)序方法(Bisulfite Sequencing PCR),通過選擇設(shè)計(jì)引物、優(yōu)化反應(yīng)條件,并采用巢式PCR方法,建立了柑橘類植物特定基因甲

7、基化研究方法,并成功地應(yīng)用于LFY基因的甲基化分析。
　　 5.采用改良的亞硫氫酸鈉修飾測(cè)序方法(Bisulfite Sequencing PCR),對(duì)早實(shí)枳不同發(fā)育階段LFY基因CpG島區(qū)域和非CpG島區(qū)域的甲基化狀態(tài)進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)LFY5’-UTR非CpG島區(qū)域的甲基化水平很低,且在不同發(fā)育階段之間沒有明顯差別；在CpG島區(qū)域,童期時(shí)存在一定程度的甲基化并且特定的位點(diǎn)分布規(guī)律,在成年期部分位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化,表明去甲基化參