GCS和MDR1在白血病細胞多藥耐藥形成中相關性的研究.pdf

1、目的:研究葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(Glucosylceramide synthase,GCS)和多藥耐藥基因1(multidrug resistance1,MDR1)在人白血病多藥耐藥細胞株K562/A02細胞耐藥形成中基因和蛋白水平的相關性及其協(xié)同機制,以便為逆轉白血病細胞耐藥提供新的思路。
　　 方法:
　　 (1)利用RT-PCR方法檢測野生株K562及其耐藥株K562/A02細胞GCS、MDR1基因的表達情況。

2、r>　　 (2)采用RNA干擾技術(RNAinterference,RNAi),將靶基因為GCS的小干擾RNA(GCSsiRNA)和靶基因為MDR1的小干擾RNA(MDR1siRNA)分別轉染K562/A02細胞48小時后,通過定性和實時定量PCR的方法觀察GCS及MDR1 mRNA的基因沉默現(xiàn)象及兩者之間的交互影響。
　　 (3)利用熒光實時定量PCR檢測GCSsiRNA轉染K562/A02細胞24小時后其GCS及MDR1

3、mRNA的表達情況,并對比分析轉染后不同時間點的基因表達,以進一步探討GCS及MDR1 mRNA的交互影響。
　　 (4)將GCSsiRNA和 MDR1siRNA分別轉染K562/A02細胞72小時后,提取各組總蛋白,采用傳統(tǒng)Westem-blot免疫印跡法,分析P-糖蛋白表達差異,從蛋白水平探尋GCS和MDR1的相關性及協(xié)同分子病理機制。
　　 結果:
　　 (1)K562/A02細胞GCS和MDR1 mRNA

4、的表達明顯強于野生株K562細胞。
　　 (2)RNA干擾實驗表明:轉染48小時后GCSsiRNA組K562/A02細胞GCS和MDR1基因的表達均被抑制,抑制率分別為73％(59～82％)和67％(38-82％),P<0.01:MDR1siRNA組K562/A02細胞MDR1基因被抑制,抑制率為81(63-91)％,P<0.01,但GCS基因表達無明顯差異,P>0.05。
　　 (3)GCSsiRNA轉染K562/A0

5、2細胞24小時后,以Mock組為對照、GAPDH基因為內標,實驗組GCS mRNA表達水平明顯受抑制,抑制率為69％(58～78％),P<0.01；以陰性組為對照,按公式計算,實驗組MDR1 mRNA表達水平無明顯差異,P>0.05。與GCSsiRNA轉染K562/A02細胞24小時比較,轉染48小時后MDR1mRNA表達下調65％(54～74％),P<0.01；GCS mRNA表達水平無明顯差異,P>0.05。
　　 (4)與

6、K562/A02細胞空白組比較,轉染72小時后GCSsiRNA組和MDR1 siRNA組細胞P-gp表達的相對光密度值分別下調1.44倍和3.54倍,P<0.05。
　　 結論:GCS與MDR1 mRNA的表達在K562/A02細胞呈正相關,特異性的沉默GCS基因可以下調MDR1 mRNA和P-糖蛋白的表達,而且這種下調是繼發(fā)性的并呈一定的時間依賴性,兩者之間可能存在一定的內在調控通路。由此,我們認為葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶和經(jīng)典的