HSPA12B對內(nèi)毒素刺激的小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景及總體思路:
　　 膿毒癥時，肺臟是最易受損傷的重要臟器之一，急性肺損傷(ALI)出現(xiàn)早，發(fā)生率高，一直是膿毒癥研究的熱點之一。內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)導(dǎo)致的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary micro-vascular endothelial cells，PMVECs)損傷，可引起肺血屏障功能障礙。膿毒癥時，內(nèi)毒素導(dǎo)致的急性肺損傷，其發(fā)生發(fā)展中關(guān)鍵細(xì)胞之一是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，保護(hù)

2、膿毒癥損傷的PMVECs具有重要的臨床價值。
　　 在膿毒癥相關(guān)性急性肺損傷研究中，不少學(xué)者重視細(xì)胞內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，關(guān)注熱點之一就是熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)。HSPs是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生增多的一類保護(hù)性蛋白質(zhì)。而其中熱休克蛋白A12B(Heat shock protein A12B，HSPA12B)是新近發(fā)現(xiàn)的一種熱休克蛋白，是HSP70家族中的遠(yuǎn)親，大量存在于動脈粥樣硬化斑塊中，與血管生

3、成保護(hù)相關(guān)。研究表明，HSPA12B在斑馬魚生長過程中和離體細(xì)胞血管形成中占有重要的作用。但膿毒癥時內(nèi)毒素對肺組織的PMVECs中HSPA12B表達(dá)變化產(chǎn)生何種影響？HSPA12B表達(dá)變化對PMVECs具有何種作用？其產(chǎn)生作用的可能機(jī)制怎樣？尚有待進(jìn)一步研究。
　　 本研究通過在體的盲腸穿孔結(jié)扎(CLP)鼠模型和LPS刺激鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的離體實驗，檢測膿毒癥時HSPA12B在各時間點的表達(dá)水平;用小干擾RNAs(siRNAs

4、)下調(diào)mPMVECs中HSPA12B后，觀察mPMVECs遷移和凋亡的變化，以及檢測LPS刺激mPMVECs產(chǎn)生的炎癥因子，研究HSPA12B對LPS處理的PMVECs的作用，并探討其與MAPK信號通路中p38的關(guān)系。
　　 第一部分膿毒癥時內(nèi)毒素對鼠肺組織中HSPA12B表達(dá)的影響
　　 目的:
　　 探討HSPA12B在盲腸穿孔結(jié)扎(CLP)鼠模型的肺組織中和LPS刺激的mPMVECs中的表達(dá)及其規(guī)律。

5、>　　 方法:
　　 1.構(gòu)建鼠CLP模型，分別在0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h斷頭取肺。應(yīng)用RT-PCR法檢測肺組織中HSPA12B mRNA的水平，探討膿毒癥時肺組織中HSPA12B表達(dá)變化。
　　 2.培養(yǎng)mPMVECs，倒置顯微鏡下觀察各時間點內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，用終濃度為1μg/ml的LPS刺激mPMVECs，分別于0h、3h、6h、9h、12h、18h、24h收集細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR法檢測HSP

6、A12B mRNA的水平，探討LPS刺激的mPMVECs中HSPA12B表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.CLP模型3h、6h、9h、12h肺組織中HSPA12B表達(dá)逐步升高，12h達(dá)峰值，后又逐漸下降。
　　 2.LPS刺激mPMVECs，HSPA12B表達(dá)也呈現(xiàn)逐步升高，后又下降。
　　 結(jié)論:
　　 膿毒癥時內(nèi)毒素對鼠肺組織和mPMVECs中HSPA12B表達(dá)具有一定影響，HSPA12B表

7、達(dá)先升高后下降。
　　 第二部分用siRNA干擾法下調(diào)原代mPMVECs上HSPA12B的表達(dá)
　　 目的:
　　 用siRNA干擾法下調(diào)原代mPMVECs上HSPA12B的表達(dá)并驗證之。
　　 方法:
　　 分別將siRNA和空白對照的siRNA通過脂質(zhì)體Lippo2000TM轉(zhuǎn)入mPMVECs內(nèi)，實驗分為兩部分:1.通過轉(zhuǎn)入帶熒光的siRNA觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率;2.用RT-PCR及Wester

8、n Blot法檢測HSPA12B的表達(dá)水平，驗證siRNA的干擾效果。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過熒光顯微鏡觀察到mPMVECs均有綠色熒光蛋白表達(dá)，說明siRNA轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)。
　　 2.RT-PCR和Western Blot檢測到rnPMVECs中HSPA12B表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建HSPA12B表達(dá)下調(diào)的mPMVECs。
　　 第三部分HSPA12B表達(dá)下調(diào)后LP

9、S對mPMVECs的遷移功能、炎癥反應(yīng)以及凋亡的影響
　　 目的:
　　 探討HSPA12B對LPS刺激的mPMVECs遷移功能、炎癥反應(yīng)和凋亡情況的影響。
　　 方法:
　　 根據(jù)以下情況將mPMVECs分為四組:①空白組、②LPS刺激組、③LPS+HSPA12B siRNA組、④LPS+空白siRNA組，分別置于37℃5％ CO2潮濕孵箱內(nèi)培養(yǎng)，用LPS與細(xì)胞共培養(yǎng)24h，取出細(xì)胞后用RT-PCR檢測

10、IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α mRNA表達(dá)情況，使用劃痕實驗和transwell小室檢測細(xì)胞遷移情況，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 RT-PCR檢測結(jié)果表明:mPMVECs經(jīng)LPS刺激24h后，與平行對照組(LPS+空白siRNA組)相比，HSPA12B表達(dá)下調(diào)組IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)水平顯著上升，而IL-10則表達(dá)下降，且均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。遷移實驗表明:與

11、平行對照組對比，HSPA12B表達(dá)下調(diào)組的mPMVECs的遷移功能明顯減弱;凋亡實驗表明:與平行對照組相比，HSPA12B表達(dá)下調(diào)組LPS刺激后mPMVECs凋亡明顯增多。
　　 結(jié)論:
　　 LPS刺激的HSPA12B表達(dá)下調(diào)的mPMVECs遷移功能減弱、炎癥反應(yīng)增強(qiáng)、凋亡明顯。說明HSPA12B可能內(nèi)毒素刺激的鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的具有一定的保護(hù)作用。
　　 第四部分HSPA12B對LPS誘導(dǎo)的mPMVECs中

12、MAPK信號通路中p38的作用
　　 目的:
　　 研究HSPA12B對LPS誘導(dǎo)的mPMVECs中MAPK信號通路中p38的作用，初步探討HSPA12B保護(hù)鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 實驗先分兩組:轉(zhuǎn)染空白siRNA組和轉(zhuǎn)染HSPA12B siRNA組，觀察LPS刺激24小時后，內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化p38(p-p38)、總p38(total p38)和β-actin蛋白表達(dá)水平;用We

13、stern blot法檢測p38表達(dá)變化情況。再將實驗分成4組①LPS組、②LPS+ siRNA組、③LPS+siRNA+p38MAPK抑制劑(SB203580)組和④LPS+siRNA+等劑量SB203580溶劑DMSO組，觀察mPMVECs遷移功能、凋亡和炎癥因子表達(dá)情況。最后LPS刺激mPMVECs24h后，用免疫熒光雙標(biāo)和免疫共沉淀方法觀察HSPA12B和p38MAPK蛋白間的相互作用。
　　 結(jié)果:
　　 We

14、stern blot分析法檢測各組p-p38、total p38和β-actin，發(fā)現(xiàn)HSPA12B干擾組p-p38顯著增強(qiáng)，p-p38和total p38灰度值之比明顯增大，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。SB203580可明顯逆轉(zhuǎn)HSPA12B表達(dá)下調(diào)所致的mPMVECs遷移功能抑制、凋亡增加和炎癥因子分泌改變。免疫熒光雙標(biāo)和免疫共沉淀實驗證實HSPA12B與p38MAPK信號通路中p38蛋白相互作用。
　　 結(jié)論: