CREB在LPS致肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過程中的作用.pdf

1、背景與目的
　　cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,能調(diào)控基因啟動(dòng)子中含有 CRE(cAMP response element)序列的目的基因轉(zhuǎn)錄,具有復(fù)雜的生物學(xué)功能。大量研究表明CREB可能在急性呼吸窘迫綜合征、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病視網(wǎng)膜病變、卵巢過度刺激綜合征等血管屏障破壞的疾病中發(fā)揮重要作用,其機(jī)制與CREB調(diào)控血管通透性和炎

2、癥反應(yīng)等密切相關(guān)。然而CREB對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響復(fù)雜,其在肺微循環(huán)屏障炎癥損傷中是否起作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬探討CREB在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)致大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rat pulmonary microvascular endothelial cell,RPMVEC)炎癥損傷過程中的作用。
　　方法
　　體外分離培養(yǎng) RPMVEC,經(jīng)不同濃度(0、0.1、1、10、100mg·L-1

3、)LPS及不同時(shí)間(0、10、30、60、120min)處理,或PKA通路特異性抑制劑(PKI)預(yù)孵育30min。Western-blot法檢測(cè) CREB磷酸化水平;伊文思藍(lán)-白蛋白法(EBA)觀察 RPMVEC單層通透性的變化。
　　結(jié)果
　　1)體外成功分離、培養(yǎng)出 RPMVEC,并經(jīng)形態(tài)學(xué)及異硫氰酸標(biāo)記的植物凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定證實(shí)。
　　2)隨著LPS孵育濃度的增加((0、0.1、1、10、100 mg·L-1)

4、,RPMVEC中CREB(Ser-133)磷酸化水平逐漸增加;10mg·L-1 LPS作用于 RPMVEC后,CREB(Ser-133)磷酸化水平呈時(shí)間依賴性地增加,30 min達(dá)高峰,隨后逐漸下降,120 min仍高于正常對(duì)照組。
　　3) LPS亦呈時(shí)間依賴性地增加CREB表達(dá),于1h開始升高,3h達(dá)峰值,隨后逐漸下降,至孵育24h表達(dá)水平仍高于正常對(duì)照組。
　　4)加入 PKA特異性通路抑制劑 PKI預(yù)孵育 RPMVE

5、C30min后,LPS誘導(dǎo)的CREB(Ser-133)磷酸化幾乎被完全抑制,與單純LPS刺激組比較,二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);PKI單獨(dú)作用于RPMVEC30min后,與正常對(duì)照組比較,二者CREB(Ser-133)磷酸化水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　5)與正常對(duì)照組相比,10mg·L-1 LPS刺激使RPMVEC的通透性顯著增加((P<0.05);而10μmol·L-1 PKI與10mg·L-1 LPS共孵育