SOCE相關(guān)蛋白在大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和作用.pdf

1、在非興奮性細(xì)胞，細(xì)胞外鈣離子最主要通過鈣池操縱的鈣通道(store-operatedCa2+channels，SOCs)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞的增殖和凋亡，因?yàn)镾OCs通道在非興奮性細(xì)胞生理作用上的特殊性和重要性，近年來越來越受到研究關(guān)注。間質(zhì)相互作用因子1(stromal interaction molecule1，STIM1)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上表達(dá)的蛋白，近年來經(jīng)大量的研究證明它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識(shí)別細(xì)胞內(nèi)鈣濃度有關(guān)

2、，鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Calcium release-activated calciumchannel proteinl，Orai1)是細(xì)胞膜上眾多的鈣離子通道之一，STIM1與Orai1現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)定為SOCs的兩個(gè)重要組成部分。
　　重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是常見急腹癥，胰腺炎的胰外器官損害很常見，其中又以急性肺損傷(acute lung injury of rats，A

3、LI)發(fā)生最為常見。近年來大量研究都證實(shí)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在急性肺損傷發(fā)病的過程中起關(guān)鍵作用。
　　目的:
　　研究大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷過程中(store-operated calcium entry，SOCE)相關(guān)蛋白的變化及抑制SOCE的影響和LPS刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后SOCE相關(guān)蛋白變化及RNA干擾后的影響，探討SOCE相關(guān)蛋白在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用，為臨床治療和預(yù)防重癥急性胰腺炎肺損傷找到新的

4、靶點(diǎn)。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:健康雄性(Spraghe-Dawley, SD)大鼠30只，體重約200g，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(CON)，2-APB治療組(2-APB+SAP)和SAP模型組(SAP)。SAP動(dòng)物模型采用1.5％的去氧膽酸鈉溶液(1ml/kg)逆行胰膽管注射法。2-APB治療組造模前24小時(shí)按腹腔注射2-APB(2.5mg/kg)。假手術(shù)組僅開腹輕翻胰腺后即關(guān)腹。造模24h后，各組大鼠麻醉后開腹，腹主動(dòng)脈

5、采血并取胰腺、肺組織。
　　觀察胰腺和肺組織的大體病理改變，HE染色法觀察肺組織及胰腺組織的病理改變，行胰腺和肺組織病理評(píng)分;取左肺組織，測(cè)定其干濕質(zhì)量，計(jì)算肺組織含水量;用全自動(dòng)血?dú)鈾z測(cè)儀進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治鰷y(cè)定，計(jì)算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2);采用碘-淀粉比色法并對(duì)血淀粉酶的含量進(jìn)行測(cè)定;使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)血清TNF-α和IL-6水平;采用Real-time PCR測(cè)定肺組織中Orai1、STIM1 mR

6、NA的水平;采用蛋白印跡(Western blot)法檢測(cè)Orai1、STIM1蛋白在肺組織中的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及造模方法同實(shí)驗(yàn)一。造模24h后，各組大鼠麻醉下開腹，取肺組織。
　　采用免疫熒光法檢測(cè)肺微血管上皮細(xì)胞Orai1、STIM1蛋白的表達(dá);采用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dUTP缺口末端標(biāo)記方法(terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-bi

7、otin nick-end labeling，TUNEL)檢測(cè)大鼠肺微血管上皮細(xì)胞凋亡的情況;應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;采用Real-time PCR檢測(cè)肺組織中Bax、caspase3mRNA的水平。
　　實(shí)驗(yàn)三:由Pricells公司購(gòu)進(jìn)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系，經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代，于第五代開始用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)在Genebank中檢索的大鼠STIM1、Orai1基因序列，設(shè)計(jì)、合成3對(duì)針對(duì)大鼠STIM1、

8、Orai1基因的小干擾RNA序列，應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，應(yīng)用Negative control FAM小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，48h后應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染效率;
　　培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞共分8組;Mock組（只加陽離子脂質(zhì)體2000，不加小干擾RNA序列）; Negative control干擾組;STIM1干擾組1;STIM1

9、干擾組2;STIM1干擾組3;Orai1干擾組1;Orai1干擾組2;Orai1干擾組3。轉(zhuǎn)染48h，應(yīng)用Real-time PCR方法驗(yàn)證其對(duì)STIM1、Orai1表達(dá)抑制的有效性，挑選抑制效應(yīng)最強(qiáng)的小干擾RNA序列進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組:空白對(duì)照組(B lank)，培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)72h; LPS刺激組，培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)48h，加入LPS(100ng/ml)繼續(xù)刺激24h;STIM1干擾組:使用陽離

10、子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA，轉(zhuǎn)染48h后，加入LPS(100ng/ml)繼續(xù)刺激24h; Orai1干擾組:使用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的siRNA，轉(zhuǎn)染48h后，加入LPS(100ng/ml)繼續(xù)刺激24h; NFATc3抑制劑組，培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)48h，加入LPS(100ng/ml)和INCA-6(1.0uM)繼續(xù)刺激24h。
　　各組細(xì)胞用藥物作用24 h后，以MTT檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞存活率;以TUNEL檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)

11、胞凋亡比率;以Western blot檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞STIM1、Orai1蛋白表達(dá)水平;以Realtime-PCR法檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中STIM1、Orai1、NFATc3、Bax和caspase3 mRNA的水平變化。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:與CON組相比，SAP組胰、肺組織病理損傷明顯，病理評(píng)分增高;肺組織含水量升高，氧合指數(shù)降低;血清淀粉酶、TNF-α和IL-6含量升高;肺組織中STIM1和Orai1 mRNA和蛋

12、白表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與SAP組相比，2-APB治療組的胰、肺病理損傷較輕，病理評(píng)分降低;肺組織含水量降低，氧合指數(shù)升高;血清淀粉酶、TNF-α和IL-6含量降低;肺組織中STIM1和Orai1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　與CON組相比，SAP組肺微血管上皮細(xì)胞Orai1、STIM1蛋白的表達(dá)明顯升高;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比率

13、增加;肺組織中Bax、caspase3 mRNA的水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)損傷明顯。
　　與SAP組相比，2-APB治療組的肺微血管上皮細(xì)胞Orai1、STIM1蛋白的表達(dá)明顯降低;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比率降低;肺組織中Bax、caspase3 mRNA的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。
　　實(shí)驗(yàn)三:
　　免疫熒光檢測(cè)小干擾RNA序列

14、轉(zhuǎn)染效率約80％;篩選出針對(duì)大鼠STIM1、Orai1的小干擾RNA序列各一條，Real-time PCR驗(yàn)證可有效抑制STIM1、Orai1mRNA轉(zhuǎn)錄水平，抑制效率在70％以上。
　　與Blank組比較，LPS組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞存活率降低、凋亡比率升高;細(xì)胞中STIM1、Orai1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平升高，NFATc3、Bax和caspase3 mRNA的水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　與LPS組比較，L

15、PS+STIM1干擾組，LPS+Orai1干擾組，LPS+INCA-6組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞存活率升高、凋亡比率降低;細(xì)胞中NFATc3、Bax和caspase3 mRNA的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.采用膽胰管逆行注射去氧膽酸鈉制備SD大鼠急性胰腺炎肺損傷的模型，可以成功的模擬重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷的癥狀。
　　2.大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷過程中，肺組織STIM1、Orai

16、1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平升高，應(yīng)用SOCE抑制劑2-APB后，STIM1、Orai1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平下調(diào)且肺損傷指標(biāo)緩解，提示SOCE在急性胰腺炎肺損傷中發(fā)揮重要作用。
　　3.SOCE參與急性胰腺炎肺損傷可能與調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。
　　4.SOC抑制劑的急性胰腺炎肺損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制線粒體介導(dǎo)凋亡相關(guān)。
　　5.LPS刺激可增高STIM1、Orai1表達(dá)，從而加重肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
　　6.針對(duì)S