Cdc42在急性肺損傷中對肺微血管內(nèi)皮細胞再生修復的影響及機制.pdf

1、急性肺損傷（Acute Lung Injury,ALI）和急性呼吸窘迫綜合癥(AcuteRespiratory Distress Syndrome，ARDS)是呼吸系統(tǒng)常見危重癥之一，對人類的健康和生產(chǎn)生活造成了嚴重的影響。目前，臨床上治療措施有限，死亡率居高不下。因此，探索ALI/ARDS的發(fā)病機制，尋求治療手段的新途徑，具有非常重要的現(xiàn)實意義。
　　ALI/ARDS的病理生理特征主要是肺內(nèi)的炎癥反應以及毛細血管膜破損導致的肺水

2、腫，在此過程中，肺微血管內(nèi)皮細胞細胞最早受到傷害，是ALI/ARDS發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，促進受損的肺微血管內(nèi)皮細胞再生，對修復微血管完整性，減輕肺組織炎性滲出，延緩肺損傷進一步發(fā)展具有重要意義。而促進血管再生修復的機制十分復雜，目前，研究者們?nèi)匀辉诓粩嗵剿髋c肺微血管內(nèi)皮再生能力相關(guān)的調(diào)控因素，籍此找到潛在的治療靶點。
　　細胞分裂周期蛋白42(cell division cycle42)，簡稱Cdc42，是Rho家族蛋白中的重要

3、成員，分子量大小為25KD。它具有很多非常重要的生物學活性，例如調(diào)控細胞周期、促進細胞增殖、遷移，維持細胞極性等等。近年來，研究者們利用Cre/Loxp條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)建動物體內(nèi)特定器官或組織上敲除Cdc42基因的模型，來探索Cdc42的調(diào)控作用及機制。
　　研究目的：
　　在本課題中，利用該技術(shù)構(gòu)建了全身血管內(nèi)皮特異性敲除Cdc42基因的小鼠，首次探索了Cdc42在急性肺損傷中對肺微血管血管內(nèi)皮損傷與修復的影響及機制，

4、旨在發(fā)現(xiàn)能夠促進血管修復、改善ALI損傷程度的有效治療手段。
　　研究方法:
　　1.體內(nèi)實驗:
　　1.1 pull-down實驗檢測急性肺損傷中肺組織的Cdc42活性水平。
　　1.2 利用cre/loxp技術(shù)構(gòu)建血管內(nèi)皮特異性敲除Cdc42基因小鼠模型，并在此基礎上再建立急性肺損傷，進行以下實驗步驟。
　　1.3 所有小鼠收集左肺組織進行固定、脫水、包埋，隨后進行HE及病理評分，免疫組化染色觀察血管內(nèi)

5、皮增殖作用;右肺收集后提取蛋白，進行western blot實驗檢測Cdc42蛋白表達水平。
　　2.體外實驗
　　2.1 培養(yǎng)原代肺微管內(nèi)皮細胞，利用cre/loxp技術(shù)構(gòu)建敲除Cdc42基因細胞模型。
　　2.2 選用人肺微血管內(nèi)皮細胞系，利用小RNA干擾技術(shù)敲低Cdc42表達;在構(gòu)建好的細胞模型中，用BrdU檢測細胞增殖能力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，細胞跨膜電阻(TEER)和異硫氰酸熒光素-右旋糖苷透過率(FI

6、TC-Dextran)評價細胞屏障功能，用Matrigel實驗檢測細胞形成血管能力。
　　2.3 提取細胞蛋白，進行western blot分析，檢測Cdc42下游相關(guān)信號通路的變化。
　　3.相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
　　研究結(jié)果:
　　1.ALI中肺組織Cdc42活性水平表達
　　LPS損傷處理后，肺組織中Cdc42GTP的表達水平有明顯改變。對比LPS未處理組（正常組），LPS1d組Cdc42GTP表達有所

7、下降，LPS處理后7天組的Cdc42GTP表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.穩(wěn)定構(gòu)建了血管內(nèi)皮細胞特異性敲除Cdc42基因的動物和原代細胞模型
　　構(gòu)建動物模型后，敲除組的肺組織中Cdc42蛋白表達明顯小于未敲除組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。原代肺微血管細胞模型中，腺病毒敲除組的Cdc42蛋白表達同樣小于對照組。
　　3.穩(wěn)定構(gòu)建了敲低Cdc42水平的HPMVE細胞系。
　　HPM

8、VEC轉(zhuǎn)染siControl質(zhì)粒及siCdc42質(zhì)粒后，三個siCdc42都能抑制Cdc42蛋白表達，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.動物水平上，在小鼠血管內(nèi)皮細胞上Cdc42基因敲除對ALI后炎性細胞浸潤、微血管滲漏以及肺微血管增殖能力的影響
　　Cdc42敲除組的ALI損傷評分、肺血管周圍中性粒細胞浸潤程度、肺微血管漏出率都明顯大于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與對照組比較，敲除組血管增殖能力明顯

9、下降。
　　5.敲低HPMVEC中Cdc42水平對細胞增殖、遷移、成管等的影響
　　與對照組相比，siCdc42組的血管內(nèi)皮增殖、遷移和血管成型能力明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義。(P＜0.05)。
　　6.敲低細胞中Cdc42表達水平可以下調(diào)PAK1/Akt信號通路的表達水平。
　　敲低Cdc42后，減少了PAK1、AKT的磷酸化及總量表達，并下調(diào)了VE-cadherin蛋白表達，對p-JNK/JNK、p-P38/

10、P38等的表達無影響。
　　研究結(jié)論:
　　1.Cdc42與肺炎性損傷的關(guān)系:Cdc42的缺失加重了ALI中的炎性細胞浸潤、肺微血管滲漏，破壞肺微血管屏障功能。因而Cdc42有可能成為改善ALI/ARDS的治療靶點。
　　2.Cdc42與肺微血管再生修復作用的關(guān)系:體內(nèi)實驗證實，敲除Cdc42基因降低了肺微血管增殖能力;體外實驗證實，下調(diào)Cdc42表達水平降低了肺微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、成管等一系列血管再生修復的能力