構(gòu)建基因敲除的動(dòng)物和細(xì)胞模型研究cdc42對(duì)急性肺損傷肺微血管屏障功能的保護(hù)作用.pdf

1、近幾十年來(lái),隨著人口老齡化時(shí)代的到來(lái),各種重癥呼吸道疾病患者的發(fā)病率逐年增加。特別是進(jìn)入二十一世紀(jì)以來(lái),各種新型的呼吸道烈性傳染病如SARS、禽流感、H1N1甲型流感等不斷肆虐全球,引起全球大流行,對(duì)人類(lèi)的健康和生產(chǎn)生活造成了嚴(yán)重的影響。目前針對(duì)這些烈性傳染病有確實(shí)療效的藥物有限,對(duì)很多重癥患者只能是對(duì)癥治療,重癥患者多數(shù)是死于急性肺損傷(Acute Lung Injury ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respirator

2、y DistressSyndrome,ARDS)。除這些烈性呼吸道傳染病外,其它各種呼吸系統(tǒng)疾病的危重患者約有一半以上的病例將會(huì)發(fā)展成ALI/ARDS,目前對(duì)ALI和ARDS尚無(wú)有效的治療措施,常規(guī)是給予高濃度氧、機(jī)械通氣、積極治療原發(fā)病、加強(qiáng)監(jiān)護(hù)和營(yíng)養(yǎng)支持等對(duì)癥支持治療。雖然機(jī)械通氣等呼吸支持技術(shù)日益提高,ALI和ARDS病死率仍然高達(dá)40％-70％。因此,深入研究ALI和ARDS的發(fā)病機(jī)制,尋求有效的治療藥物和治療手段是目前迫切需要

3、解決的問(wèn)題。
　　 急性肺損傷(Acute Lung Iinjury,ALI)是急性呼吸窘迫綜合征(AcuteRespiratory Distress Syndrome,ARDS)的早期階段。ALI和ARDS病理特征和重要的發(fā)病機(jī)制是廣泛的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的壞死、凋亡及功能失調(diào),導(dǎo)致肺微血管通透性的增加,屏障功能下降,形成肺水腫。深入探索研究肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性變化的調(diào)控機(jī)制,抑制肺微血管通透性的增加、恢復(fù)和增強(qiáng)微血管的屏障功

4、能是目前急性肺損傷防治研究的熱點(diǎn),對(duì)于預(yù)防和治療急性肺損傷以及其它炎癥和血管相關(guān)性疾病具有重要意義。
　　 影響細(xì)胞間通透性的主要是細(xì)胞間連接,在內(nèi)皮細(xì)胞中起主要作用的是黏附連接。對(duì)微血管通透性影響最重要的分子是小G蛋白家族,cdc42是小G蛋白家族中重要成員,實(shí)驗(yàn)證實(shí),cdc42可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞間連接來(lái)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能,實(shí)驗(yàn)表明,分別在心臟和肝臟敲除Cdc42基因,可以導(dǎo)致心臟的肥大和肝臟的腫大。
　　 但cdc4

5、2對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的保護(hù)作用多數(shù)是限于細(xì)胞和分子水平,動(dòng)物水平的研究鮮有報(bào)道。在細(xì)胞水平上cdc42對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能影響的研究多是用特定的內(nèi)皮細(xì)胞,如皮膚的微血管內(nèi)皮細(xì)胞、臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等,尚無(wú)對(duì)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能的研究,而且對(duì)急性肺損傷后肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能是否具有保護(hù)作用,目前尚不清楚,仍有待于進(jìn)一步的研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬利用cre/loxp技術(shù),構(gòu)建在全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠模型,以及在

6、肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的細(xì)胞模型,分別從動(dòng)物水平和細(xì)胞水平觀察敲除cdc42基因?qū)Ψ挝⒀軆?nèi)皮細(xì)胞屏障功能的影響。同時(shí),利用引進(jìn)的cdc42GAP基因敲除小鼠(cdc42GAp-/-小鼠),構(gòu)建在全身cdc42持續(xù)活化的小鼠模型,觀察其對(duì)急性肺損傷肺微血管通透性的影響。
　　 一、全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因小鼠模型的構(gòu)建采用cre/loxp技術(shù),利用從北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院引進(jìn)的在全身血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)cre

7、重組酶的小鼠(簡(jiǎn)稱(chēng)Tie2cre+/-小、鼠),以及從美國(guó)辛辛那提大學(xué)引進(jìn)的cdc42flor/flox小鼠,通過(guò)該兩種小鼠雜交,以及基因型篩選鑒定構(gòu)建在全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠模型,在活的出生后的小鼠中,未發(fā)現(xiàn)有全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠,考慮可能是敲除該基因后導(dǎo)致小鼠血管和胚胎發(fā)育障礙,不能發(fā)育成成熟小鼠。
　　 二、在全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因?qū)π∈笈咛ズ脱馨l(fā)育的影響利用cre

8、/loxp技術(shù),采用Tie2cre+/-小鼠和cdc42flox/flox雜交的方式未能有全身血管內(nèi)皮細(xì)胞敲除cdc42基因的小鼠存活,考慮敲除該基因的小鼠在胚胎期間已死亡。為此,擬進(jìn)一步研究敲除cdc42對(duì)小鼠胚胎和血管發(fā)育的影響。。Tie2cre+/-小鼠和cdc42flox/flox小鼠雜交,取基因型為cdc42flox/+Tie2cre+/-子代小鼠與cdc42flox/flox小鼠回交。母鼠懷孕后,取7.5-19.5天胎齡的小

9、鼠胚胎進(jìn)行基因型的鑒定,并觀察胚胎的大小、外形和發(fā)育的情況,以及針對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的CD31抗原而進(jìn)行的抗CD31抗體免疫組化來(lái)顯示血管發(fā)育的情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在胎齡在8.5-13.5天的小鼠胚胎中,cdc42flox/+nTie2cre+/-、cdc42flox/floxTie2cre-/-、cdc42flox/+Tie2cre-/、cdc42flox/floxTie2cre+/-這幾種可能的基因型均存在,并可見(jiàn)cdc42基因敲除

10、的胚胎所特有的200bp條帶,在胎齡14.5天及以上的鼠胚中,未見(jiàn)cdc42基因敲除的胚胎。和野生型小鼠胚胎以及和cdc42flox/flox小鼠胚胎比較,cdc42基因敲除的胚胎體型較小,發(fā)育延遲,各器官的血管稀少,有輕度水腫。提示cdc42基因?qū)ρ芎团咛サ陌l(fā)育有重要影響,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性也有重要影響。
　　 三、全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠對(duì)急性肺損傷的影響利用cre/loxp條件性基因敲除技術(shù)構(gòu)

11、建血管內(nèi)敲除cdc42基因小鼠,通過(guò)基因檢測(cè),未發(fā)現(xiàn)敲除cdc42基因的存活小鼠。但在某些情況下,某種基因敲除的雜合子可能也對(duì)生理的各項(xiàng)功能產(chǎn)生影響。在本實(shí)驗(yàn)中,擬觀察血管內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠,在急性肺損傷中對(duì)肺組織病理改變和肺微血管通透性的影響。
　　 Cdc42flox/flox小鼠與Tie2Cre+/-小鼠雜交,得到基因型為Cdc42flox/+Tie2Cre+/-子代小鼠和Cdc42 flox/+Tie2Cr

12、e-/-子代小鼠,再取Cde42 flox/+Tie2Cre+/-基因型的子代小鼠與Cdc42 flox/flox小鼠回交,得到基因型為Cdc42 flox/+Tie2Cre+/-、Cdc42flox/+Tie2Cre-/-、Cdc42 flox/flox Tie2Cre-/-三種基因型小鼠,Cdc42 flox/+Tie2Cre+/-為血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠,基因型Cdc42flox/+Tie2Cre-/-小鼠和

13、Cdc42flox/flox Tie2Cre-/-小鼠為對(duì)照組,三組小鼠經(jīng)氣道內(nèi)給予LPS造成急性肺損傷模型,分別檢測(cè)肺組織損傷病理評(píng)分、肺微血管通透系數(shù)、肺濕/干重比等指標(biāo),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),三組小鼠的肺病理評(píng)分分別為9.25±1.488,9.38±2.387,8.50±0.926,整體均值比較p=0.409。三組小鼠肺微血管通透系數(shù)分別為0.0467±0.0227、0.0494±0.0115、0.0325±0.0105伊文思

14、/肺組織(mg/g),整體均值比較p=0.073。三組小鼠的肺濕干重比值分別為5.77±1.13、6.35±1.20、7.98±2.72,整體均值比較p=0.37。在上述三種指標(biāo)檢測(cè)方面無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示全身血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠對(duì)急性肺損傷的屏障功能無(wú)明顯影響。
　　 四、構(gòu)建體內(nèi)cdc42持續(xù)活化的小鼠模型并研究cdc42持續(xù)活化對(duì)急性肺損傷的影響動(dòng)物或細(xì)胞內(nèi)的cdc42與GDP或GTP結(jié)合存在。C

15、dc42與GDP結(jié)合呈非活化狀態(tài),而與GTP結(jié)合,則變成活化狀態(tài),從而表達(dá)cdc42的活性。在負(fù)性調(diào)節(jié)因子cdc42 GTP酶活化蛋白(cdc42 GTPase Activating Proteins cdc42GAP)的作用下,cdc42GTP將脫去一個(gè)磷酸,形成cdc42-GDP的非活化狀態(tài)[20]。若在動(dòng)物模型中敲除cdc42GAP基因,則喪失cdc42GAP的作用,cdc42將被持續(xù)活化。
　　 利用引進(jìn)的cdc42GA

16、P雜合子小鼠,構(gòu)建在全身敲除cdc42基因的小鼠,制成全身過(guò)度活化cdc42的小鼠模型,來(lái)觀察過(guò)度活化cdc42是否對(duì)肺損傷具有保護(hù)作用。在cdc42GAP-/-小鼠和野生型小鼠分別經(jīng)氣道內(nèi)給予LPS造成急性肺損傷模型,檢測(cè)對(duì)肺組織病理改變的影響,初步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)度活化cdc42對(duì)急性肺損傷具有保護(hù)作用。
　　 五、構(gòu)建在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的細(xì)胞模型,以及觀察敲除該基因后對(duì)單層肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。
　

17、　 采用Tie2cre+/-小鼠和cdc42flox/flox小鼠雜交的方式構(gòu)建在血管內(nèi)皮內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠,未能有敲除該基因的小鼠存活。則調(diào)整實(shí)驗(yàn)策略,利用腺病毒作為載體,攜帶cre重組酶,感染從cdc42flox/flox小鼠上分離培養(yǎng)的構(gòu)建在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)敲除cdc42基因的細(xì)胞模型,給予LPS刺激,制成肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞急性損傷模型,和野生型肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞急性損傷模型比較,觀察敲除cdc42對(duì)單層肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞屏

18、障功能和細(xì)胞間連接的影響。
　　 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)以及鑒定工作已完成,從野生型小鼠及從cdc42flox/flox小鼠身上分離培養(yǎng)的肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)情況無(wú)明顯差異,其跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻也無(wú)明顯差異。已完成攜帶cre重組酶的腺病毒載體構(gòu)建的大部分工作,已完成包含cre重組酶全長(zhǎng)基因組的穿梭載體的構(gòu)建,已轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌,正進(jìn)行陽(yáng)性菌落的挑選。
　　 全文總結(jié):我們擬構(gòu)建血管內(nèi)敲除cdc42基因的小鼠模型,來(lái)研究

19、cdc42對(duì)急性肺損傷肺微血管通透性的影響,但血管內(nèi)敲除cdc42基因影響小鼠胚胎和血管的發(fā)育,導(dǎo)致胚胎發(fā)育延遲、血管稀少,胚胎水腫,不能發(fā)育成成熟小鼠,提示cdc42對(duì)胚胎和血管的發(fā)育,以及血管的通透性有重要影響。但血管內(nèi)敲除cdc42基因的雜合子小鼠對(duì)急性肺損傷無(wú)明顯保護(hù)作用。利用引進(jìn)的cdc42GAP基因敲除的雜合子小鼠,構(gòu)建在體內(nèi)過(guò)度活化cdc42的小鼠模型,初步證明過(guò)度活化cdc42對(duì)急性肺損傷具有重要作用。現(xiàn)正利用攜帶cre