王不留行抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞有效部位的分離純化及其藥效評(píng)價(jià).pdf

1、背景與目的：腫瘤血管生成為腫瘤惡性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)和途徑，因此抑制腫瘤血管生成是腫瘤生物防治新策略，引起了極大的興趣和關(guān)注，目前數(shù)十種針對(duì)腫瘤血管形成的分子機(jī)制所設(shè)計(jì)的抗血管生成劑已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)在血管發(fā)生中具有重要作用，內(nèi)皮細(xì)胞由骨髓源原祖細(xì)胞分化而來(lái)，其分化的過(guò)程復(fù)雜，受到多種因素調(diào)控，目前還不能清楚的解釋具體的調(diào)控過(guò)程。通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖可以抵抗腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤的惡性生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。本研究擬采

2、用內(nèi)皮細(xì)胞模型從中藥庫(kù)中篩選具有抗血管生成的中藥，對(duì)其水煎劑進(jìn)行體內(nèi)體外藥效學(xué)鑒定，同時(shí)分離純化具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的有效單一組分，然后對(duì)該組分進(jìn)行體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)。研究方法：將中藥材水煎劑經(jīng)大孔樹脂吸附進(jìn)行總皂苷的分離純化，分別收集不同濃度乙醇溶液洗脫液，用SFJ3(磺酰羅丹明B)法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，選擇有效部分用AKTAresource柱分離，按紫外吸收峰收集洗脫液并進(jìn)行活性驗(yàn)證，蒸發(fā)光散射檢測(cè)組分復(fù)雜程度，選擇活性高、豐度大、成份簡(jiǎn)

3、單的峰進(jìn)行C18柱分離。通過(guò)改變流動(dòng)相和色譜柱進(jìn)行分離條件優(yōu)化，同時(shí)按等體積分段收集有效部位，進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)和HPLC分析。SRB細(xì)胞增殖抑制法測(cè)定IC50值；通過(guò)控制藥物作用時(shí)間確定時(shí)間與藥效關(guān)系；劃線灼傷法研究細(xì)胞遷移；體外基質(zhì)膠細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)分析提取物對(duì)細(xì)胞黏附能力的影響；HE染色觀察藥物對(duì)細(xì)胞染色體的影響。結(jié)果：王不留行水煎劑經(jīng)大孔樹脂分離和細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)50％～70％乙醇濃度洗脫液具有細(xì)胞活性，經(jīng)AKTA resource柱

4、分離得(0～6)七種組份群，細(xì)胞活性測(cè)得(3～6)號(hào)組分有活性，選擇4號(hào)組分經(jīng)C18柱分離得五組分(A～E)，組分B為有紫外吸收的主峰，但無(wú)細(xì)胞活性，其活性分布于組分D和組分E中。組分D經(jīng)蒸發(fā)光散射檢測(cè)為單峰，而組分E包含有4中化合物，鑒于組分E具有很高的細(xì)胞活性和豐度，因此對(duì)其進(jìn)一步分析，通過(guò)添加甲酸改變流動(dòng)相pH值可以明顯改善分離效果，用乙腈代替甲醇也能使組分E按基線分離。通過(guò)SRB法測(cè)定組分E的IC50值為3.60μg/ml，時(shí)間

5、與藥效關(guān)系表明加藥后4h藥效起作用。遷移實(shí)驗(yàn)表明加藥48h后加藥組的細(xì)胞遷移受到明顯抑制，其遷移率為40.33％，對(duì)照組遷移率為77.68％(P<0.05)。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)表明加藥組細(xì)胞黏附受到明顯抑制，且呈濃度依賴關(guān)系。 結(jié)論：經(jīng)上述方法篩選出王不留行具有抗血管生成活性，其水煎劑具有明顯的新生血管抑制作用。通過(guò)對(duì)其水煎劑進(jìn)行分離純化獲得了單一組分群，該組分呈白色晶體，極易溶液水。體外細(xì)胞水平評(píng)價(jià)該組分群具有極強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制活性