Rab26調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細胞β2-AR和TLR4受體失衡的作用及機制_.pdf

1、ALI/ARDS一直是危重病領(lǐng)域非常重視的研究熱點，其基本病理生理特點明確為肺微血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞等的損傷，由此導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)減少，細胞通透性增加、多形核白細胞細胞大量聚集和炎癥激活，最終形成廣泛的肺水腫等病理表現(xiàn)。可見肺微血管內(nèi)皮的損傷在急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）時處于首要地位，是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因之一。β2-AR和TLR4這兩類受體均存在于PMECs并保持平衡，維持細胞正常生命活動。主要是正

2、常受體如β2-AR被激活，發(fā)揮生物性能。而病理情況下，PMECs應(yīng)答脂多糖等炎癥刺激時，兩類受體的表達和功能均要發(fā)生較大的變化，如TLR4受體將被激活，而正常受體如β2-AR會受損傷，從而打破了兩類受體表達及介導(dǎo)炎癥功能的平衡，導(dǎo)致炎癥失控，最終引起ALI。
　　Rab26為一種小G蛋白，屬于Ras超家族，在HEK293細胞中，Rab26可調(diào)控細胞表面α(2A)-AR和α(2B)-AR的表達，同時ERK1/2被α(2)-AT激活，

3、通過調(diào)節(jié)Rab分子和相互作用蛋白，對細胞分泌顆粒的成熟發(fā)揮效應(yīng)。但目前Rab26在肺組織細胞中研究甚少。
　　因此，利用LPS刺激肺微血管內(nèi)皮后觀察細胞表面β2-AR和TLR4表達變化情況，以及相應(yīng)siRNA沉默和激動劑處理細胞后二者的變化情況，進一步探索兩受體失衡的現(xiàn)象，并初步研究Rab26質(zhì)粒對兩種受體失衡的調(diào)控作用。
　　研究方法：
　　1.應(yīng)用β2-AR和TLR4 siRNA轉(zhuǎn)染PMECs，檢測兩者mRNA和蛋

4、白水平表達。
　　2.應(yīng)用β2-AR和TLR4激動劑處理PMECs，觀察兩種受體基因和蛋白表達。
　　3.流式細胞儀檢測Rab26質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PMECs的轉(zhuǎn)染效率，并應(yīng)用RT-PCR和Western Bolt檢測其表達情況。
　　4. ELISA檢測PMECs處理后上清中各炎癥因子的表達。
　　5. BSA檢測PMECs滲透性。
　　研究結(jié)果：
　　1. LPS處理HPMECs后，細胞表面β2-AR降低，

5、而TLR4表達升高，初步證實受體失衡的現(xiàn)象。
　　2.利用β2-AR和TLR4的siRNA轉(zhuǎn)染PMECs后，檢測結(jié)果顯示β2-AR siRNA作用后細胞表面TLR4表達有上調(diào)，炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α表達升高；而TLR4 siRNA處理后，HPMECs細胞內(nèi)β2-AR表達有升高趨勢，炎癥因子的表達降低。
　　3.依據(jù)時間濃度依賴曲線實驗結(jié)果，β2-AR和TLR4激動劑腎上腺素（EPI）和LPS最佳時間點為6h，

6、濃度為50pmol/L和2ng/ul。結(jié)果表明EPI處理后β2-AR表達升高，而TLR4降低；在兩種激動劑同時作用后，有一定的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。
　　4. LPS處理HPMECs后，Rab26mRNA和蛋白表達降低；利用GDP活性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Rab26 mRNA和蛋白表達降低，同時β2-AR表達亦降低，而TLR4表達升高，IL-6、IL-8、TNF-α分泌升高,細胞滲透性增加；GTP活性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Rab26 mRNA和蛋白升高，β2-A