大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞β腎上腺素受體胞內(nèi)運(yùn)輸及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的變化與調(diào)節(jié).pdf

1、溺海肺損傷包括肺的結(jié)構(gòu)損傷和功能降低。海水淹溺后,引起死亡的主要原因是海水淹溺肺水腫(pulmonary edema of sea water drowning,PE-SWD)。肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(microvascular endothelial cells,MVEC)是位于循環(huán)血液與組織液之間的單層扁平上皮細(xì)胞,溺海肺損傷時(shí),肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)遭到破壞,使其對(duì)液體及溶質(zhì)的通透性增加,造成滲透性肺水腫。因此降低微血管內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性

2、是治療溺海肺損傷的重要環(huán)節(jié)。
　　 Beta-腎上腺素受體(Beta-adrenergic receptorβ-AR)無論是在病理情況下還是生理情況下,對(duì)微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和滲透性的調(diào)節(jié)都起著十分重要的作用。Β-腎上腺素受體各個(gè)亞型,包括β1-AR,β2-AR和β3-AR,在脈管系統(tǒng)均發(fā)揮一定的作用。許多研究證明,受體激動(dòng)劑激活β2-AR后可在一定程度上減輕有致炎因子所導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的增高,但改變程度有限,臨床效果并不理想

3、。有研究表明這可能與β2-AR在細(xì)胞膜的表達(dá)水平有關(guān),具體機(jī)制不明。最近的研究表明Rab1可調(diào)節(jié)β-AR在細(xì)胞膜上的表達(dá),為臨床藥物干預(yù)提供了新的靶點(diǎn)和策略。
　　 β-AR的胞內(nèi)運(yùn)輸對(duì)發(fā)揮其正常功能是十分重要的。Β-AR在細(xì)胞表面上表達(dá)的水平是受體內(nèi)化、循環(huán)和降解三方面平衡調(diào)節(jié)的結(jié)果。以往的研究也往往集中在受體內(nèi)化、循環(huán)和降解這三個(gè)方面,而受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細(xì)胞膜的運(yùn)輸路徑以及這些路徑對(duì)受體功能的影響卻知之甚少。
　　 事

4、實(shí)上,受體在細(xì)胞器間的運(yùn)輸是受Rab蛋白調(diào)節(jié)的。Rab蛋白是Ras超家族的一個(gè)成員,目前在人類基因組中已證實(shí)的有60多種。幾乎所有的Rab蛋白都參與了細(xì)胞中囊泡的形成、對(duì)接或融合,也參與了細(xì)胞的胞吞和胞吐過程。內(nèi)皮細(xì)胞主要表達(dá)Rab1-9,11,13,14,15,18,22和30。Rab1存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,主要參與蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的順向調(diào)節(jié)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在HEK293T細(xì)胞和心肌細(xì)胞中,Rab1參于了G蛋白偶聯(lián)受體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向

5、高爾基體運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié),表明Rab1功能的改變可能影響內(nèi)皮細(xì)胞表面β-AR的表達(dá),繼而影響細(xì)胞的滲透性。
　　 本實(shí)驗(yàn)試通過轉(zhuǎn)染野生型Rab1、Rab1突變體及Rab1小片段RNA觀察β-AR在大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的表達(dá)和功能,同時(shí)探討Rab1對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞滲透性的影響。
　　 研究內(nèi)容:
　　 1.采用外周肺組織貼塊法培養(yǎng)大鼠RPMVECs,對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行CD34、植物凝集素BSI、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)

6、胞化學(xué)染色鑒定,通過光鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)。
　　 2.運(yùn)用配體飽和測(cè)定法測(cè)定大鼠RPMVECs海水和LPS處理后、慢病毒包裝的Rab1WT轉(zhuǎn)染后β-AR在胞膜上的表達(dá)。
　　 3.運(yùn)用熒光顯微鏡檢測(cè)慢病毒包裝的Rab1WT、Rab1N124I和Rab1siRNA轉(zhuǎn)染PMVEC后β-AR在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布狀況。
　　 4.運(yùn)用Western Blot檢測(cè)慢病毒包裝的Rab1WT和Rab1N124

7、I轉(zhuǎn)染PMVEC后pERK1/2的表達(dá)情況。
　　 5.運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)RPMVECs用海水、LPS處理以及轉(zhuǎn)染Rab1WT后對(duì)牛血清白蛋白(BSA)的透過情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.組織塊法培養(yǎng)大鼠RPMVECs的綜合鑒定結(jié)果顯示:組織塊源于外周肺組織,Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34免疫熒光化學(xué)染色陽性,植物凝集素BSI結(jié)合試驗(yàn)陽性,透射電鏡細(xì)胞表面有較多突起,胞漿中有較多吞飲小泡。
　　 2.海水

8、及LPS處理后β-AR在胞膜上的表達(dá)明顯降低,轉(zhuǎn)染Rab1WT后可恢復(fù)β-AR在胞膜上的表達(dá)。
　　 3.轉(zhuǎn)染Rab1WT后β-AR主要在胞膜上表達(dá),轉(zhuǎn)染Rab1N124I和Rab1siRNA后β-AR主要積聚在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
　　 4.轉(zhuǎn)染Rab1WT后pERK1/2的表達(dá)明顯升高,轉(zhuǎn)染Rab1N124I后Rab1WT后pERK1/2的表達(dá)明顯降低。
　　 5.海水及LPS處理后對(duì)RPMVECs牛血清白蛋白(BSA)