糖基化終末產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑.pdf

1、前言：糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見而嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制可能與糖基化終末產(chǎn)物(Advanced glycation end products，AGEs)誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)。AGEs是機(jī)體在長期高血糖狀態(tài)下體內(nèi)蛋白質(zhì)的氨基與糖的醛基之間發(fā)生的非酶性糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物的總稱。糖尿病視網(wǎng)膜病變時(shí)AGEs積聚，與其受體(receptor for AGEs，RAGE)結(jié)合

2、，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，影響細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本文旨在研究糖尿病視網(wǎng)膜病變中AGEs對于大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal microvascular endothelial cells，RMECs)的作用及相關(guān)因子的表達(dá)。同時(shí)由于他汀類(statins)藥物不僅具有降低血脂、抑制膽固醇合成的作用，而且也可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、提高內(nèi)皮源性一氧化氮合酶的活性、抗炎、抗氧化、逆轉(zhuǎn)血管重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)也試圖

3、探討他汀類藥物和抗氧化劑丙丁酚對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。 方法 體外培養(yǎng)RMECs，制備糖基化終末產(chǎn)物-糖基化白蛋白(AGE-BSA)．采用Western blot 法、RT-PCR法檢測不同濃度AGE-BSA及相同濃度AGE-BSA作用不同時(shí)間的RAGE、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH)、血管細(xì)胞粘附分

4、子-1(Vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1)的表達(dá)變化。通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的熒光強(qiáng)度，應(yīng)用免疫熒光法觀察核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活化。同時(shí)研究了給予普伐他汀和/或丙丁酚作用下AGE-BSA誘導(dǎo)的RMECs中RAGE表達(dá)的變化。 結(jié)果 隨著AGE-BSA濃

5、度的增加和作用時(shí)間的延長，RMECs處RAGE mRNA水平、NADPH氧化酶mRNA水平、VCAM-1蛋白表達(dá)及ROS的產(chǎn)生逐漸增多，呈劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)。無AGE-BSA刺激時(shí)，NF-κB主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)；AGE-BSA刺激后NF-κB主要表達(dá)在核內(nèi)，作用30min時(shí)達(dá)高峰。AGE-BSA(100 mg/L)作用下RAGE mRNA水平明顯升高，分別加入普伐他汀和丙丁酚后RAGE mRNA水平減少，聯(lián)合應(yīng)用普伐他汀和丙丁酚時(shí)RAGE

6、 mRNA水平明顯減少。 討論 DR是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的一種慢性并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，一般認(rèn)為是由于視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)損傷所致。AGEs在視網(wǎng)膜微血管系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RMECs處，AGEs增加時(shí)可上調(diào)RAGE的表達(dá)。RAGE與AGEs結(jié)合，相互作用觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 NADPH氧化酶是由多個(gè)亞基組成的酶復(fù)合體，在RMECs，AGE-BSA的作用顯著地增加了NAD

7、PH氧化酶mRNA水平，使其處于活化狀態(tài)。另外，結(jié)果證實(shí)檢測ROS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度隨著AGE-BSA的濃度的增加和作用時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng)，氧化應(yīng)激損傷逐漸加重。而應(yīng)用NADPH氧化酶的抑制劑-apocynin后ROS熒光值下降，說明NADPH氧化酶的活化在RAGE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中起了重要作用，NADPH氧化酶途徑是內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的來源之一。ROS在血管內(nèi)皮細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)及增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。 Sulcin

8、er等認(rèn)為NF-κB是內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS作用的主要靶點(diǎn)，其活化與內(nèi)皮細(xì)胞生存和功能失調(diào)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光顯微鏡檢測NF-κB活化，發(fā)現(xiàn)AGE-BSA作用于RMECs后NF-κB開始活化，30 min達(dá)到高峰，激活的NF-kB從細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)DNA特定部位，激活細(xì)胞因子、粘附分子及生長因子等引起多種基因的表達(dá)協(xié)同增加，NF-κB激活是誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。 YCAM-1主要介導(dǎo)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性

9、粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附遷移，是血管內(nèi)皮細(xì)胞表面重要的粘附分子。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中，VCAM-1隨著AGE-BSA作用下表達(dá)明顯增加，內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷加重，炎癥發(fā)生發(fā)展，NF-kB是調(diào)控VCAM-1基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，在大多數(shù)粘附分子基因的啟動(dòng)區(qū)存在著NF-kB的結(jié)合位點(diǎn)，AGE-BSA誘導(dǎo)的VCAM-1的蛋白表達(dá)增加是由依賴于NF-kB的。聯(lián)合應(yīng)用普伐他汀和丙丁酚與單獨(dú)應(yīng)用兩種藥物相比也

10、可以使AGE-BSA誘導(dǎo)的RAGE mRNA水平降低更為明顯。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用這兩種藥物效果較好，可能成為糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的一個(gè)潛在的治療策略。 結(jié)論 1.AGE-BSA可以促進(jìn)RMECs的YCAM-1的表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)呈劑量及時(shí)間依賴效應(yīng)； 2.AGE-BSA可以促進(jìn)RMECs的RAGE的表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)呈劑量及時(shí)間依賴效應(yīng)，AGEs和RAGE結(jié)合發(fā)揮作用； 3.NF-kB的活化是其關(guān)