阻斷腎上腺素能受體對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分:普萘洛爾、酚妥拉明抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成
　　目的：研究離體情況下，β-AR阻斷劑普萘洛爾、α-AR阻斷劑酚妥拉明對(duì)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2表達(dá)的影響。
　　方法：1.細(xì)胞免疫熒光鑒定內(nèi)皮細(xì)胞:細(xì)胞采用免疫熒光染色Ⅷ因子進(jìn)行鑒定。將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔板爬片。待細(xì)胞

2、融合至80％-90％時(shí)，4％冰多聚甲醛固定20分鐘，0.2％TritonⅩ-100通透10分鐘，羊血清封閉30分鐘。兔多克?、蜃?vWF)一抗4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜。TRITC標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育2小時(shí)（避光）。Hochest(1μg/ml)染核15分鐘（避光）后10％甘油封片。正置熒光顯微鏡下觀察、拍片（×200倍）。
　　2.Western blot檢測(cè)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞α-AR的表達(dá):未經(jīng)藥物處理的人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦微血

3、管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)裂解獲得總蛋白。BCA定量，沸水滅活。取總蛋白約40μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％BSA封閉1小時(shí)，蛋白樣品分別在4℃冰箱孵育兔多克隆抗α1-AR、α2-AR一抗過(guò)夜。次日在37℃孵箱中孵育相應(yīng)的二抗1h。采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，于暗室內(nèi)壓片，顯影定影。
　　3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于96孔板，將不同濃度梯度的普萘洛爾（0，25，50，75，100μM）、酚妥

4、拉明（0，10，30，50，70μg/ml）分別處理細(xì)胞48h。然后每孔加入10μlCCK-8，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h。之后于酶標(biāo)儀測(cè)450nm下吸光度值。
　　4.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn):將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于96孔板，將不同濃度梯度的普萘洛爾（0，25，50，75，100μM）、酚妥拉明（0，10，30，50，70μg/ml）分別處理細(xì)胞48h。收集細(xì)胞上清液各60μl于96孔板內(nèi)，每孔加入60μl乳酸脫氫酶工作液。室溫30分鐘后，于

5、酶標(biāo)儀測(cè)490nm下吸光度值。
　　5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn):將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于24孔板，細(xì)胞融合100％后，低血清培養(yǎng)基饑餓24h，用20μl槍頭在孔板中央劃寬約1mm劃痕，PBS洗去死細(xì)胞，各孔加入含不同濃度普萘洛爾(0，0.1，1，10，20，30μM)、酚妥拉明(0，0.1，1，10，20，40μg/ml)的低血清培養(yǎng)基，繼續(xù)孵箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡下觀察0，12，24，48 h劃痕愈合情況并拍照(40倍)。
　

6、　6.細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn):Matrigel基質(zhì)膠(12.5 mg/ml)在4℃溶解，24孔板、槍頭皆預(yù)冷，冰上操作。于24孔板中加入100μl基質(zhì)膠，均勻平鋪。將其放入37℃孵箱，待基質(zhì)膠凝固后，分別均勻加入500μl含1.5×105個(gè)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37℃孵箱中孵育。待細(xì)胞貼壁后，去除舊培養(yǎng)基，分別加入含0、50μM普萘洛爾、0、50μg/ml酚妥拉明的完全培養(yǎng)基，倒置熒光顯微鏡下觀察0，4，8，

7、12，24h細(xì)胞在基質(zhì)膠上的管樣形成情況并拍照(40倍)。
　　7.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞VEGF的變化:將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于6孔板，細(xì)胞融合至70％時(shí)，去掉舊培養(yǎng)基，PBS洗去殘留培養(yǎng)基，加入分別含0、50μM普萘洛爾、0、50μg/ml酚妥拉明的高血清無(wú)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h。提取細(xì)胞總蛋白及細(xì)胞上清液，按VEGF ELISA試劑盒說(shuō)明方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清中VEGF的表達(dá)情況。
　　8.E

8、LISA法檢測(cè)細(xì)胞VEGFR-2的變化:將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞種植于6孔板，細(xì)胞融合至70％時(shí)，去掉舊培養(yǎng)基，PBS洗去殘留培養(yǎng)基，加入分別含0、50μM普萘洛爾、0、50μg/ml酚妥拉明的完全培養(yǎng)基，孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h。提取細(xì)胞總蛋白，BCA定量，統(tǒng)一各孔蛋白量，按VEGFR-2 ELISA試劑盒說(shuō)明方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)VEGFR-2的表達(dá)情況。
　　9.Western blot檢測(cè)人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ang1、Ang2、Tie-2的

9、表達(dá):將人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞分別用含0、50μM普萘洛爾、0、50μg/ml酚妥拉明的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，裂解細(xì)胞獲得總蛋白。BCA定量，沸水滅活。取總蛋白約40μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5％BSA封閉1小時(shí)，蛋白樣品分別在4℃冰箱孵育兔多克隆抗Ang1、Ang2、鼠單克隆抗Tie-2一抗過(guò)夜。次日在37℃孵箱中孵育相應(yīng)的二抗1h。采用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，于暗室內(nèi)壓片，顯影定影。
　　結(jié)

10、果：1.兩種細(xì)胞Ⅷ因子皆陽(yáng)性，表明這兩種細(xì)胞皆為內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)源。
　　2.人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)α1-AR(α1A-AR(50kDa)和α1D-AR(60kDa)亞型）和α2-AR(50 kDa)。人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)α1-AR(位于34 kDa to43 kDa之間的三個(gè)α1A-AR亞型(35kDa，37kDa和40kDa)）和α2-AR(50 kDa)，這是第一次報(bào)導(dǎo)人微血管來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)α-AR。
　　3.普萘洛爾

11、和酚妥拉明皆呈劑量依賴性抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，半抑制率分別位于50μM、50μg/ml附近。
　　4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中采用的濃度梯度內(nèi)的藥物未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性作用，間接證明普萘洛爾和酚妥拉明減少細(xì)胞數(shù)量是因?yàn)樗幬锉旧韺?duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，而非藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用。
　　5.普萘洛爾和酚妥拉明皆抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。48h后，藥物處理組（普萘洛爾20、30μM;酚妥拉明20、40μg/ml）劃痕寬度明顯大于對(duì)照

12、組。低濃度藥物組亦抑制細(xì)胞遷移，但不明顯。
　　6.普萘洛爾和酚妥拉明皆抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管。普萘洛爾抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管達(dá)40.3％、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞72.7％，酚妥拉明抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管達(dá)65.7％、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞77.7％。
　　7.普萘洛爾和酚妥拉明皆抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2的表達(dá)，但是對(duì)胞內(nèi)VEGF和上清VEGF無(wú)明顯影響。普萘洛爾對(duì)人皮膚微血管內(nèi)皮

13、細(xì)胞VEGFR-2的抑制達(dá)22.4％，酚妥拉明抑制率達(dá)24.4％。對(duì)照組細(xì)胞上清中VEGF濃度很低（＜13.9 pg/ml），實(shí)驗(yàn)組上清中基本無(wú)VEGF，但二者無(wú)明顯差異(p＞0.05)。
　　8.普萘洛爾和酚妥拉明皆抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ang1、Ang2的表達(dá)，但促進(jìn)Tie-2的表達(dá)。
　　結(jié)論：普萘洛爾和酚妥拉明皆抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、成管，該作用可能與普萘洛爾和酚妥拉明抑制細(xì)胞VEGFR-2、Ang1、Ang2的

14、表達(dá)有關(guān)。
　　第二部分:同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外血管生成
　　目的：研究離體情況下，同時(shí)阻斷人微血管內(nèi)皮細(xì)胞α-AR、β-AR是否協(xié)同抑制細(xì)胞血管生成。
　　方法：1.實(shí)驗(yàn)分組:第一組:酚妥拉明50μg/ml;第二組:普萘洛爾50μM;第三組酚妥拉明50μg/ml+普萘洛爾50μM，分別進(jìn)行增殖、成管實(shí)驗(yàn)及VEGF、VEGFR-2、Ang1、Ang2、Tie-2的檢測(cè);劃痕實(shí)驗(yàn)中，由于該

15、實(shí)驗(yàn)營(yíng)養(yǎng)條件降低，藥物濃度降為酚妥拉明20μg/ml、普萘洛爾20μM。
　　2.增殖、劃痕、成管、ELISA、Western blot具體方法見(jiàn)第一部分。
　　結(jié)果：1.同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。藥物處理后，酚妥拉明+普萘洛爾組細(xì)胞數(shù)量較酚妥拉明組少45.5％，普萘洛爾組少43.5％。
　　2.同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。48h后，酚妥拉明+普萘洛爾組

16、劃痕寬度明顯大于酚妥拉明組和普萘洛爾組。
　　3.同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞、人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管。藥物處理細(xì)胞后4h，酚妥拉明組和普萘洛爾組可見(jiàn)明顯成管，酚妥拉明+普萘洛爾組成管不明顯。藥物處理細(xì)胞后8h，酚妥拉明組和普萘洛爾組成管數(shù)量及長(zhǎng)度明顯大于酚妥拉明+普萘洛爾組。
　　4.同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR-2的表達(dá)。藥物作用48h后，酚妥拉明+普萘洛爾組

17、酶標(biāo)儀下OD值較酚妥拉明組少33.3％，較普萘洛爾組少35％。三個(gè)組胞內(nèi)VEGF無(wú)明顯差別，上清中基本無(wú)VEGF，亦無(wú)明顯差別。
　　5.同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞Ang1、Ang2、Tie-2的表達(dá)。藥物處理細(xì)胞后，酚妥拉明+普萘洛爾組細(xì)胞Ang1表達(dá)輕微下調(diào)，Ang2表達(dá)明顯下調(diào)，而Tie-2表達(dá)明顯下調(diào)，與預(yù)期中Tie-2表達(dá)應(yīng)上升相反。
　　結(jié)論：同時(shí)阻斷α-AR、β-AR協(xié)同抑制內(nèi)皮細(xì)胞