攜帶Rab26 siRNA的自組裝DNA納米載體調(diào)控肺微血管內(nèi)皮滲透性及機制研究.pdf

1、肺微血管內(nèi)皮細胞組成的內(nèi)皮屏障，維持著肺間質(zhì)與血液中的滲透壓平衡，調(diào)控著血液中炎癥細胞、蛋白等物質(zhì)的運輸。各種因素導(dǎo)致的內(nèi)皮連接破壞、內(nèi)皮細胞凋亡及壞死破壞了內(nèi)皮屏障的完整性，影響了內(nèi)皮屏障功能，導(dǎo)致了血漿蛋白及致炎因子滲出、肺間質(zhì)及肺泡水腫。故內(nèi)皮完整性的破壞及內(nèi)皮滲透性的增高是急性肺損傷重要發(fā)病病理基礎(chǔ)之一，研究其發(fā)生機制，有利于急性肺損傷的干預(yù)及治療。
　　革蘭氏陰性桿菌感染是急性肺損傷的重要誘發(fā)因素之一，革蘭氏陰性桿菌的崩

2、解產(chǎn)物脂多糖(LPS)是炎癥反應(yīng)的重要促發(fā)因子，其可與細胞表面TLR4受體特異性結(jié)合，激活TLR4-NF-κB信號通路并由此誘導(dǎo)細胞對其產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，過度激活的TLR4-NF-κB信號將導(dǎo)致炎癥的發(fā)生和發(fā)展。另外，TLR4不僅能識別LPS等病原體相關(guān)分子模式，其對于無菌性損傷后產(chǎn)生的內(nèi)源性致炎因子即損傷相關(guān)分子模式也有應(yīng)答反應(yīng)。故TLR4不僅能應(yīng)答由革蘭氏陰性桿菌感染所引起的炎癥反應(yīng)，也能應(yīng)答由非特異損傷導(dǎo)致的無菌性炎癥。由此可見，在急

3、性肺損傷中，TLR4及其下游信號通路的激活及失控可能在炎癥的發(fā)生、發(fā)展及失控中發(fā)揮重要作用。既往研究表明:TLR4可在肺微血管內(nèi)皮細胞上表達，參與了多種炎癥信號的傳遞過程，將TLR4過表達后將加重肺損傷，而抑制TLR4信號傳遞后可以阻止肺微血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白的重排，抑制細胞間縫隙的形成并由此減輕或阻止肺水腫的發(fā)生。故TLR4可能成為急性肺損傷及急性呼吸窘迫綜合癥治療中一個重要的干預(yù)靶點。
　　Rab蛋白是一類小GTP結(jié)合蛋白，具

4、有GTP酶活性，故又稱為Rab GTPase，其能調(diào)控細胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的運輸，并由此調(diào)控囊泡內(nèi)蛋白質(zhì)在細胞中的轉(zhuǎn)運。不同的Rab蛋白具有不同的功能，我們先前的研究揭示了，Rab1可調(diào)控β2-腎上腺素受體及血管緊張素Ⅱ1型受體在大鼠肺動脈平滑肌細胞膜及細胞內(nèi)的分布，Rab5a可調(diào)節(jié)β2-腎上腺素受體在肺微血管內(nèi)皮細胞中的轉(zhuǎn)運及胞膜上的表達，也能夠調(diào)節(jié)該細胞中VE-cadherin的內(nèi)吞及F-actin的定位。而Rab26是一種主要調(diào)控順向轉(zhuǎn)

5、運的Rab蛋白，可以調(diào)控囊泡從高爾基體到細胞膜的轉(zhuǎn)運。而TLR4作為膜受體在細胞內(nèi)合成后需轉(zhuǎn)運至胞膜才能應(yīng)答配體傳遞的刺激，那么，Rab26能否調(diào)節(jié)肺微血管內(nèi)皮細胞中TLR4受體的轉(zhuǎn)運和表達，繼而引起其對LPS等致炎因子應(yīng)答的改變，并由此調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細胞屏障功能？目前尚不清楚。
　　納米材料在醫(yī)學(xué)研究及診治中有著巨大的應(yīng)用前景。早期的研究主要集中在無機納米材料的應(yīng)用方面，例如常見的有納米金在診斷中的應(yīng)用及納米銀在抗菌方面的應(yīng)用

6、等。因納米材料具有多種特有的優(yōu)勢，在生命科學(xué)領(lǐng)域，近幾十年來各種先進的納米材料被合成。而通過DNA堿基互補配對自組裝而成的納米材料，因其具有成本低廉、組裝容易、易編程、可修飾等特性，非常便于在醫(yī)學(xué)研究以及診斷治療的應(yīng)用，而其作為載體在遞送siRNA進行研究和基因診斷治療方面有著低毒、低免疫原性、血清穩(wěn)定性佳等獨特優(yōu)勢。在本研究中，我們合成了兩種納米載體ssRNA-TNP及siRab26-DYM，分別探討了這兩種納米載體與單一siRNA相

7、比的應(yīng)用優(yōu)勢。并使用納米載體研究了Rab26對LPS引起的肺微血管內(nèi)皮細胞TLR4及NF-κB P65變化所產(chǎn)生影響。然后，我們還檢測了Rab26對肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡及滲透性的影響，進一步明確了Rab26在肺微血管內(nèi)皮細胞應(yīng)對炎癥因子刺激時所發(fā)揮的作用。
　　目的:
　　1.合成具有低毒性及良好轉(zhuǎn)染效果的DNA自組裝納米載體。
　　2.明確Rab26對HPMVECs中TLR4及下游信號通路的調(diào)節(jié)作用。
　　3.

8、探討Rab26對HPMVECs細胞凋亡及內(nèi)皮細胞滲透性的影響。
　　方法:
　　1.構(gòu)建并驗證DNA自組裝納米載體。
　　(1)構(gòu)建能夠攜帶mTOR siRNA的DNA三角板納米載體，檢測其產(chǎn)率、轉(zhuǎn)染效率及細胞攝取率。
　　(2)構(gòu)建能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)運Rab26siRNA的DNA三臂Y型模體結(jié)構(gòu)納米載體siRab26-DYM，并檢測其納米載體產(chǎn)率、轉(zhuǎn)染效率及細胞攝取率。
　　(3)使用RT-PCR及WB檢測siR

9、ab26-DYM對HPMVECs細胞中Rab26基因表達的干擾效果。
　　2.培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細胞，檢測LPS及Rab26對HPMVECs細胞Rab26、TLR4及其下游信號通路的影響。
　　(1)使用Westernblot探測HPMVECs中Rab26及TLR4的表達變化。
　　(2)采用流式細胞術(shù)檢測HPMVECs細胞膜TLR4的改變。
　　(3)使用流式細胞術(shù)檢測Rab26對HPMVECs細胞膜TLR4受

10、體的調(diào)節(jié)作用。
　　(4)使用WB檢測Rab26對HPMVECs細胞總TLR4蛋白及其下游通路分子NF-κBP65的調(diào)控。
　　3.檢測LPS及Rab26對HPMVECs細胞凋亡率及其內(nèi)皮細胞滲透性的影響
　　(1)使用流式細胞術(shù)檢測Rab26對HPMVECs細胞凋亡率的影響。
　　(2)使用Transwell小室培養(yǎng)HPMVECs，通過檢測FITC-dextran的透過率以反映HPMVECs內(nèi)皮細胞通透性。

11、r>　　結(jié)果:
　　1.成功組裝了能攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體以及能攜帶Rab26siRNA的Y形模體結(jié)構(gòu)納米載體。凝膠電泳結(jié)果分析顯示:通過階梯降溫法納米載體能完成自組裝并達到較高的產(chǎn)率。
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體以及攜帶Rab26siRNA的Y型模體納米載體能被細胞高效攝入。通過對攜帶Rab26siRNA的Y型模體納米載體的進一步研究發(fā)現(xiàn)，其能高效沉默目的基因

12、Rab26的表達，且具有濃度及時間依賴性，RT-PCR及Westernblot結(jié)果顯示此種納米載體能導(dǎo)致HPMVECs細胞中目的基因Rab26在mRNA及蛋白水平的表達下降。
　　3.LPS處理HPMVECs后Rab26的表達出現(xiàn)了下降，細胞膜TLR4及細胞總TLR4蛋白的表達出現(xiàn)了上升。
　　4.下調(diào)HPMVECs細胞中Rab26能提高細胞膜TLR4、細胞總TLR4以及下游NF-κBP65的表達，而上調(diào)HPMVECs細胞中

13、的Rab26能降低由LPS引起的TLR4及NF-κB P65的升高。
　　5.LPS處理HPMVECs后，細胞的凋亡率增高，而下調(diào)HPMVECs細胞Rab26的表達，能與LPS協(xié)同作用提高HPMVECs細胞的凋亡,上調(diào)HPMVECs細胞中Rab26能降低LPS刺激后出現(xiàn)的細胞凋亡。
　　6.LPS刺激后，HPMVECs細胞滲透性出現(xiàn)了提高，而下調(diào)Rab26能與LPS協(xié)同作用進一步提高HPMVECs內(nèi)皮細胞滲透性，上調(diào)Rab2

14、6能一定程度降低由LPS刺激所導(dǎo)致的HPMVECs內(nèi)皮細胞滲透性的提高。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建能夠自組裝的攜帶mTOR siRNA的DNA自組裝三角板納米載體及能攜帶Rab26siRNA的DNA納米Y型模體納米載體，其合成方法簡單，產(chǎn)率高，這兩種納米載體能夠高效的轉(zhuǎn)入細胞。對攜帶Rab26siRNA的DNA納米Y型模體納米載體的進一步研究發(fā)現(xiàn)，其能高效的干擾目標(biāo)基因的表達。
　　2.LPS可降低HPMVECs中