低溫對大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞的影響及TRPM8參與調(diào)控的機制.pdf

1、寒冷作為一種有害的環(huán)境因素,可導(dǎo)致機體多種疾病的發(fā)生,其中以凍瘡、凍傷等冷誘導(dǎo)機體肢端損傷的發(fā)生最為常見。以往關(guān)于冷誘導(dǎo)機體肢端損傷的研究表明,皮下微循環(huán)障礙是寒冷損傷發(fā)生發(fā)展的始動因素,而寒冷誘導(dǎo)的皮下微血管內(nèi)皮細胞功能紊亂則在這一過程中起到關(guān)鍵作用。因此,許多學(xué)者提出,血管內(nèi)皮細胞是機體冷暴露過程中最先做出反應(yīng)并受到損傷的部位。另外,不同程度低溫持續(xù)暴露?？墒箼C體肢端皮膚出現(xiàn)不同的改變。正常情況下,人體的皮溫為32℃;當(dāng)皮膚溫度降至

2、29℃時,機體即可感到不適;降至28℃以下時,軀體即感覺到?jīng)鏊?降至17℃以下時,機體出現(xiàn)疼痛感,此時可能發(fā)生凍瘡;當(dāng)溫度降至12℃以下時,麻木感出現(xiàn),常可見浸漬足或戰(zhàn)壕足的發(fā)生;而在8℃以下則徹底失去痛覺感受,至0℃即刻,皮下微血管系統(tǒng)即可出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變與亞細胞結(jié)構(gòu)改變;至-2℃以下,皮膚及皮下血管即可發(fā)生凍結(jié),發(fā)生凍傷。這些結(jié)果提示,在機體冷損傷發(fā)生發(fā)展的過程,皮下微血管內(nèi)皮細胞經(jīng)歷了不同程度低溫的刺激并發(fā)生了相應(yīng)的病變,進而

3、導(dǎo)致不同程度冷損傷的發(fā)生。真皮微血管內(nèi)皮細胞(dermal micorvascular endothelial cells,DMVECs)作為皮膚組織最外層部位的一類血管內(nèi)皮細胞,在機體進出不同溫度環(huán)境的過程中,必然經(jīng)歷了不同溫度的刺激,并產(chǎn)生相應(yīng)功能的改變。目前,關(guān)于DMVECs如何感知低溫刺激以及低溫直接導(dǎo)致其損傷的分子機制仍不明確,但是,瞬時感受器電位離子通道家族(transient Receptor Potential,TRP)

4、的發(fā)現(xiàn)及其功能的揭示可能為我們提供了一條可尋的途徑。TRPs是一類可被多種因素刺激激活后允許陽離子通過的膜離子通道,很多研究表明,其在血管內(nèi)皮細胞功能的調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用。另外,該家族中包括TRPV1、V2、V4,TRPM8及TRPA1在內(nèi)的成員被證實是機體感知不同環(huán)境溫度的關(guān)鍵,其中TRPM8可在28℃至8℃范圍內(nèi)開放,這恰與前述寒冷損傷過程中真皮微血管內(nèi)皮細胞所經(jīng)歷的溫度范圍趨于一致。因此,本研究擬通過建立體外大鼠DMVECs低溫暴

5、露模型,探討不同程度低溫對DMVECs的影響是否存在差異,也就是說,DMVECs是否能夠感知不同程度低溫的刺激并做出不同反應(yīng),另外,我們擬通過對DMVECs中TRPM8的表達進行鑒定,初步探討低溫影響大鼠DMVECs的分子機制,從而為進一步探索冷誘導(dǎo)機體肢端損傷的機制,預(yù)防和診斷冷損傷疾病的發(fā)生以及開展促機體冷習(xí)服藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　研究目的:
　　通過建立體外大鼠DMVECs低溫暴露模型,闡明不同低溫刺激對大鼠D

6、MVECs的影響,明確大鼠DMVECs對不同低溫刺激的反應(yīng),并通過對大鼠DMVECsTRPM8的表達及功能進行分析,初步探討低溫影響大鼠DMVECs功能改變的分子機制。
　　研究方法:
　　1.大鼠DMVECs的培養(yǎng)與鑒定:采用非連續(xù)密度梯度Percoll分離法制備大鼠DMVECs;通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫熒光鑒定、CD31免疫熒光鑒定以及植物凝集素結(jié)合實驗對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　2.大鼠DMVEC

7、s低溫暴露模型的建立:將DMVECs分別于不同程度低溫(28℃、12℃及0℃)條件下暴露24h,以37℃為對照組,通過細胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT法檢測細胞活力及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)測定試劑盒測定細胞培養(yǎng)上清中LDH活性,對低溫暴露模型進行評價,并初步探討大鼠DMVECs接受不同低溫刺激后的反應(yīng)。
　　3.不同低溫暴露對大鼠DMVECs細胞相關(guān)細胞因子基因表達的影響:采用RT-PCR法對不同低

8、溫刺激后大鼠DMVECs中包括血管通透因子VEGF及AQP-1,血管收縮因子ET-1,細胞粘附分子ICAM-1,細胞炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α等在內(nèi)的細胞因子mRNA表達情況進行半定量分析,探討大鼠DMVECs對不同程度低溫刺激反應(yīng)后相關(guān)基因的表達差異。
　　4.大鼠DMVECs中TRPM8的鑒定:通過設(shè)計大鼠TRPM8mRNA的上下游引物,采用RT-PCR法對其mRNA表達進行初步鑒定,并對PCR產(chǎn)物進行測序分析;

9、采用免疫熒光雙染法對大鼠DMVECs中TRPM8蛋白的表達進行鑒定。
　　5.TRPM8參與低溫對DMVECs功能影響的機制:采用不同濃度AMTB(25μmol/L及75μmol/L)阻斷大鼠DMVECsTRPM8通道后,將DMVECs于12℃暴露12h,而后利用RT-PCR法對DMVECs的VEGF、ET-1及IL-6等細胞因子及TRPM8的基因表達情況進行半定量分析,初步明確大鼠DMVECsTRPM8的通道活性,探討其參與低溫

10、對大鼠DMVECs功能影響的可能機制。
　　研究結(jié)果:
　　1.大鼠DMVECs的培養(yǎng)與鑒定:分離于21-35％梯度間的細胞于培養(yǎng)后第五天融合成單層細胞,且呈典型的鋪路石樣結(jié)構(gòu),Ⅷ因子相關(guān)抗原及CD31表達均呈陽性,植物凝集素(BSI)結(jié)合實驗也呈陽性結(jié)果,證明所培養(yǎng)的細胞為大鼠真皮微血管內(nèi)皮。
　　2.大鼠DMVECs低溫暴露模型的建立:大鼠DMVECs于不同低溫條件(28℃、12℃及0℃)暴露24h后,與37℃組比

11、較,28℃組細胞形態(tài)無明顯改變,12℃組趨于“成纖維樣”變化,但細胞形態(tài)保持完整,僅部分細胞間出現(xiàn)縫隙,0℃組細胞則出現(xiàn)明顯皺縮;MTT結(jié)果顯示,28℃組、12℃組及0℃組細胞增殖率較37℃組分別下降了4%、10%以及20%(P<0.05),且各低溫組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示大鼠DMVECs細胞增殖率可隨溫度降低而降低;28℃、12℃及0℃組細胞培養(yǎng)液中LDH活性(U/L)分別為54.17±3.02,64.66±3.

12、03,82.13±10.91,與37℃組(12.23±3.03)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明隨溫度降低,大鼠DMVECs細胞損傷程度加重。以上結(jié)果表明大鼠DMVECs低溫暴露模型構(gòu)建成功。
　　3.不同低溫對大鼠DMVECs相關(guān)細胞因子基因表達的影響:于28℃、12℃及0℃暴露24h后,大鼠DMVECs相關(guān)因子mRNA表達的變化結(jié)果如下:
　?、賄EGFmRNA在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為0.86

13、±0.04、1.04±0.04和0.64±0.01,其中28℃組和12℃組較37℃組(0.64±0.01)表達上調(diào)(P<0.05),且兩組間存在一定差異(P<0.05),0℃較37℃無明顯改變。提示,28℃及12℃可促進大鼠DMVECs中VEGF的基因表達出現(xiàn)不同程度的上調(diào);
　?、贏QP-1mRNA在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為1.72±0.04、1.77±0.03及1.37±0.06,28℃組及12℃組較37℃組(1

14、.45±0.04)表達上調(diào)(P<0.05),但兩組間無顯著差異,而0℃組與37℃組比較無明顯改變。提示,28℃及12℃可促進大鼠DMVECs中AQP-1的基因表達上調(diào);
　?、跡T-1mRNA在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為0.85±0.04、1.04±0.04和0.45±0.02。12℃組較37℃組表達上調(diào)(P<0.01),0℃組較37℃組(0.87±0.02)表達下降(P<0.01),而28℃組較37℃組表達無明顯改變

15、。提示12℃可促進大鼠DMVECsET-1的基因表達上調(diào),而0℃則使其表達減少;
　?、躀CAM-1mRNA在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為1.24±0.01、1.50±0.04及1.01±0.01。28℃和12℃較37℃(1.04±0.02)表達上調(diào)(P<0.05),且該兩組間存在差異(P<0.05)。提示,28℃組及12℃組可促進大鼠DMVECsICAM-1的基因表達出現(xiàn)不同程度的上調(diào);
　　⑤IL-1βmRNA

16、在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為0.37±0.01、0.38±0.03及0.46±0.02,28℃組、12℃組及0℃組較37℃組(0.67±0.02)表達均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01),提示28℃、12℃及0℃均可使大鼠DMVECsIL-1β的表達減少;
　?、轎L-6mRNA在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為0.89±0.02、1.02±0.03及0.67±0.03,12℃組較37℃組表達(0.89±0.02)顯著

17、上調(diào)(P<0.01),0℃組較37℃組表達顯著下降(P<0.01),而28℃組較37℃組表達無明顯改變。提示12℃可刺激大鼠DMVECsIL-6mRNA的基因表達上調(diào),而0℃則使其表達減少;
　　⑦TNF-αmRNA在28℃、12℃及0℃的相對表達量分別為0.26±0.02、0.15±0.02及0.21±0.02,28℃組及0℃組較37℃組(0.14±0.01)表達顯著上調(diào)(P<0.01),而12℃組較37℃組表達無明顯改變,提示

18、28℃及0℃可促進大鼠DMVECsTNF--α的基因表達上調(diào)。
　　4.大鼠DMVECs中TRPM8的表達與鑒定:RT-PCR結(jié)果顯示,在目的產(chǎn)物大小(216bp)的位置可見陽性條帶,經(jīng)測序,該產(chǎn)物與Genebank中褐家鼠TRPM8mRNA的匹配度為98%,證明大鼠DMVECs中存在TRPM8mRNA的表達;免疫熒光雙染結(jié)果顯示,在BSI結(jié)合呈陽性的細胞中,存在TRPM8蛋白的表達,證明大鼠DMVECs存在TRPM8蛋白的表達。

19、
　　5.TRPM8參與低溫對DMVECs功能影響的機制:在AMTB存在的情況下,于12℃暴露12h后,75μmol/LAMTB組大鼠DMVEC細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯皺縮,提示,TRPM8被阻斷后,12℃可引起大鼠DMVECs細胞形態(tài)改變;在12℃條件下暴露12h后,VEGF、ET-1、IL-6及TRPM8基因表達情況分別為:
　?、賄EGFmRNA在0h對照組、12h對照組、DMSO組、25μmol/LAMTB組及75μmol/

20、LAMTB組的相對表達量分別為0.94±0.01、1.02±0.03、1.02±0.02、0.94±0.01和0.93±0.02。其中,12h對照組及DMSO組較0h對照組表達上調(diào),提示低溫暴露模型成功,但25μmol/LAMTB組及75μmol/LAMTB組較DMSO組表達下降(P<0.05)。提示TRPM8參與了12℃引起的大鼠DMVECsVEGF基因表達上調(diào);
　?、贓T-1mRNA在0h對照組、12h對照組、DMSO組、2

21、5μmol/LAMTB組及75μmol/LAMTB組的相對表達量分別為0.73±0.03、0.94±0.01、0.96±0.02、0.73±0.01及0.53±0.02。其中,25μmol/LAMTB組ET-1的mRNA表達量較12h組及DMSO組為表達減少;75μmol/LAMTB組mRNA表達量較12h對照組、DMSO組及25μmol/LAMTB組表達顯著下降(P<0.01)。提示,TRPM8參與了12℃引起的大鼠DMVECsET-

22、1的基因表達上調(diào);
　?、跧L-6mRNA在0h對照組、12h對照組、DMSO組、25μmol/LAMTB組及75μmol/LAMTB組的相對表達量分別為0.26±0.03,0.57±0.04、0.62±0.02、0.67±0.01及0.77±0.01。275μmol/LAMTB組較DMSO組表達顯著上調(diào)(P<0.01)。提示,TRPM8參與了低溫引起的大鼠DMVECsIL-6基因表達上調(diào);
　?、躎RPM8mRNA在0h對

23、照組、12h對照組、DMSO組、25μmol/LAMTB組及75μmol/LAMTB組的相對表達量分別為0.54±0.01、0.74±0.01、0.76±0.03、0.67±0.01及0.54±0.01。25μmol/LAMTB組及75μmol/LAMTB組較DMSO組表達下調(diào)(P<0.01)。提示,TRPM8參與了12℃引起的大鼠DMVECs中其自身基因表達上調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.采用非連續(xù)密度梯度Percoll分離法

24、可成功制備大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞;
　　2.大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞可在28℃、12℃及0℃作用下在細胞形態(tài)、細胞活力、細胞膜完整性及相關(guān)細胞因子基因表達調(diào)控等方面表現(xiàn)出不同程度的改變。提示低溫可以對大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞相關(guān)功能產(chǎn)生直接影響，而大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞可能具有感知不同低溫刺激的能力;
　　3.大鼠真皮微血管內(nèi)皮細胞具有TRPM8的活性表達，其參與了12℃對細胞相關(guān)細胞因子基因表達的影響;
　　4.低溫可能