EphA2在人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接形成和血管發(fā)生中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 腦的毛細(xì)血管又稱腦微血管,屬連續(xù)性血管,以網(wǎng)狀存在于腦實(shí)質(zhì)內(nèi),在腦微血管內(nèi)側(cè)壁分布著毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC),它是一層單層細(xì)胞,之間以緊密連接封閉。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管發(fā)生與性狀改變與很多神經(jīng)和血管疾病密切相關(guān)。
　　 血腦屏障(Blood-brain Barrier,BBB)由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成,屬于一種代謝和生理性屏障結(jié)構(gòu)。其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(BMEC)是構(gòu)成血腦屏障的主要

2、結(jié)構(gòu),它將中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境與外周循環(huán)系統(tǒng)分隔開來,可阻止多種物質(zhì)進(jìn)入腦,但營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物可順利通過,以維持神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。與外周血管內(nèi)皮細(xì)胞不同,它具有高跨內(nèi)皮阻抗(transendothelialelectrical resistance,TEER)、細(xì)胞間緊密連接、極少的胞飲小泡、缺乏窗孔結(jié)構(gòu)以及含有選擇性雙向跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等獨(dú)有的特征,從而使血腦屏障形成一個限制大多數(shù)極性分子和蛋白質(zhì)運(yùn)動的選擇性低滲透性的屏障。

3、由于高能量需要和缺乏內(nèi)源性能量來源,腦組織高度依賴持續(xù)的血液供應(yīng),所以血管內(nèi)皮細(xì)胞的破壞和血流灌注不足可以嚴(yán)重影響神經(jīng)活動。血腦屏障對于維持正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能非常重要。
　　 血腦屏障處于大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞水平,其特點(diǎn)是限制細(xì)胞間擴(kuò)散,減少胞吞作用和離子、多肽、營養(yǎng)成分特殊運(yùn)載體的出現(xiàn),這使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定性受到嚴(yán)密控制。血腦屏障這些特點(diǎn)由血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞足底過程調(diào)節(jié)控制。目前,關(guān)于BME

4、C血管發(fā)生的研究較少,對于BMEC血管發(fā)生的分子機(jī)制,BMEC血管發(fā)生與BBB形成以及BMEC緊密連接形成的關(guān)系,尚不清楚。
　　 Eph受體和其配體ephrin都是膜結(jié)合蛋白,是細(xì)胞.細(xì)胞間信號傳遞的重要介質(zhì),調(diào)節(jié)著細(xì)胞的黏附,塑形,遷移。Eph受體家族是酪氨酸受體家族中最大的亞族,共有14個成員,根據(jù)序列相似性和與配體結(jié)和力不同分為A、B兩族。A族配體通過GPI位點(diǎn)與膜結(jié)合,B族通過一個跨膜區(qū)與膜結(jié)合,有PDZ末端。近年的研

5、究表明,Eph受體/ephrin配體存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞上,尤其是Eph受體/ephrin配體在腫瘤新生血管中的作用機(jī)制研究較多。但是Eph受體/ephrin配體是否在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMEC)上表達(dá)以及它的特點(diǎn)和作用機(jī)制,尚不清楚。
　　 綜上,我們首先探討EphA受體與ephrin-A配體在HBMEC上的表達(dá)譜,闡明哪些EphA受體與ephrin-A配體在HBMEC上表達(dá)。然后選取感興趣的一個EphA受體,探討其與緊密連接

6、和血管發(fā)生的關(guān)系及相關(guān)機(jī)制。這項(xiàng)研究對于腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、確定EphA受體/ephrin-A配體家族在HBMEC上的表達(dá)譜
　　 (一)細(xì)胞培養(yǎng)
　　 HBMEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液。
　　 (二)巢式PCR技術(shù)定性檢測EphA受體/ephrin-A配體家族在HBMEC上的mRNA表達(dá)情

7、況。
　　 (三)克隆測序
　　 (四)RT-PCR技術(shù)檢測EphA受體/ephrin-A配體家族在HBMEC上的mRNA表達(dá)情況。
　　 1、HBMEC生長在35mm塑料培養(yǎng)皿內(nèi),待細(xì)胞融合成單層后,用Trizol裂解細(xì)胞制成細(xì)胞裂解液,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
　　 2、用HBMEC的cDNA作模板,分別用EphA1-EphA8,EphA10,ephrin-A1-ephrin-A5,的各自引物,用PCR的方

8、法檢測EpkA/ephrin-A受體/配體家族在HBMEC上的核酸表達(dá)情況。
　　 (五)Western Blot技術(shù)檢測EphA受體/ephrin-A配體在HBMEC上的蛋白表達(dá)情況。
　　 1、HBMEC生長在25cm2克氏瓶內(nèi),待細(xì)胞融合成單層后,用RIPA裂解細(xì)胞制成細(xì)胞裂解液。
　　 2、用Western Blot的方法檢測EphA受體/ephrin-A配體家族在HBMEC上的蛋白表達(dá)情況。
　　

9、 (六)用統(tǒng)計學(xué)方法分析每個EphA/ephrin-A受體/配體在HBMEC上的核酸表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平的相對多少。
　　 二、探討EphA2對BBB的緊密連接形成的作用
　　 (一)用免疫沉淀的方法檢測ephrin-A1配體分別與EphA家族受體互作時各個受體的磷酸化情況。
　　 1、將生長狀態(tài)良好的HBMEC種植在100mm塑料平皿上,待細(xì)胞融合至100％時,血清饑餓24小時后,按2.5μg/ml加入ep

10、hrin-A1蛋白純品,作用30min后收樣。
　　 2、按照免疫沉淀的方法,先用酪氨酸磷酸化抗體“拉”,再分別用可以在HBMEC上表達(dá)的EphA1-EphA4,EphA6,EphA7抗體“雜”。
　　 3、用Western Blot的方法檢測ephrin-A1配體分別與EphA家族受體互作時各個受體的磷酸化情況。
　　 (二)建立EphA2干擾的HBMECs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(EphA2siRNAs)
　　

11、 EphA2 siRNAs穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMECs的細(xì)胞株,并用Western-Blot方法鑒定。
　　 (三)真核表達(dá)載體構(gòu)建,Lipo2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMECs,建立EphA2激酶失活的HBMECs細(xì)胞株(即HBMECEphA2 K646M)
　　 1、重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Myc-his B-EphA2 K646M的構(gòu)建
　　 2、真核表達(dá)載體構(gòu)建。
　　 3、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBMECs細(xì)胞株。

12、　　 (四)血腦屏障體外模型的建立及HBMEC單層通透性研究
　　 1、將培養(yǎng)的HBMEC在生長狀態(tài)良好時,按2×105/ml加到Transwell上室,Transwell下室加入0.8ml培養(yǎng)液,待細(xì)胞長成為具有緊密連接的內(nèi)皮細(xì)胞單層時,即BBB模型建立。
　　 2、TEER的分析將正常HBMEC、EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMECEphA2siRNA與EphA2激酶失活突變株HBMECEphA2 K646

13、M(轉(zhuǎn)染EphA2激酶失活鑒定成功)分別接種到Transwell建立BBB模型,3天后測定跨上皮細(xì)胞電阻(TransEpithelial Electrical Resistance,TEER)。
　　 3、HRP flux分析
　　 (1)將正常HBMEC、EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMECEphA2 siRNA與EphA2激酶失活突變株HBMECEphA2 K646M(轉(zhuǎn)染EphA2激酶失活鑒定成功)分別接種

14、到Transwell建立BBB模型。
　　 (2)采用示蹤分子HRP穿過HBMEC單層。
　　 (3)酶標(biāo)儀讀取OD492值。
　　 (五)免疫熒光技術(shù)檢測緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)
　　 1、將HBMEC,EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMECEphA2 siRNA與EphA2激酶失活突變株HBMECEphA2 K646M(轉(zhuǎn)染EphA2激酶失活鑒定成功)分別接種到蓋片上。
　　 2、待細(xì)

15、胞長滿后2-3天時,通過免疫熒光法觀察緊密連接蛋白ZO-1分布。
　　 (六)免疫熒光技術(shù)檢測緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)
　　 1、將HBMEC,EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMECEphA2 siRNA與EphA2激酶失活突變株HBMECEphA2 K646M(轉(zhuǎn)染EphA2激酶失活鑒定成功)分別接種到蓋片上。
　　 2、待細(xì)胞長滿后2-3天時,通過免疫熒光法觀察緊密連接蛋白Occludin分布

16、。
　　 (七)Western Blot檢測可溶性與不可溶性O(shè)ccludin表達(dá)的變化
　　 1、對HBMEC進(jìn)行occludin抽提
　　 2、用Western Blot的方法檢測HBMEC和加入ephrinA1配體的HBMEC中可溶性occludin與不可溶性occludin的蛋白變化情況。
　　 三、探討EphA2對BBB的血管發(fā)生的作用
　　 (一)細(xì)胞培養(yǎng)
　　 1、HBMEC細(xì)

17、胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液。
　　 2、siRNA干擾EphA2的細(xì)胞株HBMECEphA2 siRNA培養(yǎng)于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液(使用時按6gμl/ml加入G418)。
　　 3、EphA2激酶失活～HBMEC細(xì)胞株HBMEC EphA2 K646M培養(yǎng)于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培養(yǎng)液(使用時按6μ/ml加入G418)。

18、
　　 (二)劃痕法(scratch wound assay)檢測內(nèi)皮細(xì)胞遷移
　　 1、檢測HBMEC與加入ephrinA1配體的HBMEC的細(xì)胞遷移變化情況。
　　 2、檢測siRNA干擾EphA2的細(xì)胞株HBMECEphA2 siRNA與non-silence細(xì)胞株的細(xì)胞遷移變化情況。
　　 3、檢測EphA2激酶失活的HBMEC細(xì)胞株HBMEC EphA2 K646M細(xì)胞與vector細(xì)胞株的細(xì)胞

19、遷移變化情況。
　　 (三)血管生成實(shí)驗(yàn)
　　 1、將HBMEC,EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMECEphA2 siRNA與EphA2激酶失活突變株HBMECEphA2 K646M(轉(zhuǎn)染EphA2激酶失活鑒定成功),按105/ml分別種到24孔板里的matrigel上。
　　 2、在0h,4h,8h,12h,24h分別用倒置顯微鏡拍照。
　　 3、用統(tǒng)計學(xué)的方法分析差異。
　　 結(jié)果：<

20、br>　　 一、EphA受體/ephrin-A配體家族在HBMEC上共有11個成員表達(dá)
　　 (一)EphA1-EphA4,EphA6,EphA7,EphA10,ephrin-A1,ephrin-A3-ephrin-A5在HBMEC上表達(dá)。
　　 (二)其中EphA2,EphA7,ephrin-A1,ephrin-A3表達(dá)較高。
　　 二、EphA2的Knock down或功能缺失突變促進(jìn)緊密連接的形成

21、　　 (一)EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMEC EphA2 siRNA的TEER比non-silence的阻值高;HRP Flux比non-silence的低。
　　 (二)EphA2激酶失活突變株的HBMEC EphA2 K646M的TEER比vector的阻值高;HRP Flux比vector的低。
　　 (三)EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMEC EphA2 siRNA和EphA2激酶失活突變株

22、的HBMEC EphA2 K646M在加入配體ephrin-A1后,緊密連接保持完整。
　　 (四)正常HBMEC、non-silence和vector細(xì)胞株在加入配體ephrin-A1后,緊密連接遭到破壞。
　　 三、EphA2的Knock down或功能缺失突變抑制血管生成
　　 (一)EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMEC EphA2 siRNA的血管發(fā)生受到抑制。
　　 (二)EphA2激酶

23、失活突變株的HBMEC EphA2 K646M的血管發(fā)生受到抑制。
　　 (三)EphA2干擾的HBMECs細(xì)胞株HBMEC EphA2 siRNA經(jīng)過24小時后愈合程度明顯低于non-silence細(xì)胞,48小時后non-silence細(xì)胞基本愈合。
　　 (四)EphA2激酶失活突變株的HBMEC EphA2 K646M經(jīng)過24小時后愈合程度明顯低于vgctor細(xì)胞,,48小時后vector細(xì)胞基本愈合。