NF-κB p65 siRNA轉染體外抑制VSMC增殖和防治移植靜脈內膜增生的實驗研究.pdf

1、背景:冠狀動脈旁路移植術(CABG)是目前用于治療冠狀動脈嚴重狹窄性病變、改善心肌組織缺血的有效治療方法，自體靜脈是被廣泛用作冠狀動脈旁路移植手術的靜脈血管材料，然而術后移植靜脈粥樣硬化性狹窄閉塞嚴重影響其治療效果。血管壁炎性反應和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)增殖、內膜增生是靜脈血管橋粥樣硬化再狹窄的重要特征，是多因素造成的血管壁損傷修復的漸進性病理變化過程，多項實驗證實核轉錄因子

2、kappa B(NF-κB)是靜脈移植術后血管壁炎性反應、內膜VSMC增殖的關鍵核轉錄調節(jié)因子，因此RNA干擾技術阻斷NF-κB表達，可以有效抑制炎性反應、減輕細胞增殖分化、防止移植靜脈粥樣硬化再狹窄的發(fā)生發(fā)展，通過基因治療學策略抑制這種病理性增生已經成為目前研究的重點。
　　目的:體外細胞學實驗研究NF-κB p65基因的siRNA(Small interfering RNA)重組質粒脂質體復合物轉染大鼠VSMC，通過VSMC細

3、胞培養(yǎng)研究p65 siRNA對平滑肌細胞的增殖活性、凋亡情況及炎性細胞因子表達的影響。建立大鼠頸外靜脈—腹主動脈自體靜脈移植模型，動物實驗研究p65 siRNA質粒脂質體轉染移植靜脈，檢測血管組織中NF-κB p65蛋白、炎性因子TNF-α和MCP-1的表達水平，觀察siRNA對炎性因子表達的阻斷作用和對移植靜脈血管組織VSMC增殖導致再狹窄的防治效果。
　　方法:通過體外細胞學轉染實驗及大鼠移植靜脈血管橋轉染研究，采用RNA干擾

4、(RNAinterference，RNAi）原理阻斷NF-κB的激活，即通過siRNA達到目的基因轉錄后沉默，減輕炎性反應，抑制VSMC增殖，延緩移植靜脈內膜增生再狹窄。
　　一、NF-κB p65的siRNA設計合成和構建表達:根據大鼠NF-κB基因數(shù)據庫中提供的其p65亞基的基因堿基序列，選定其中（5′-AAG CAC AGA TAC CAC TAA GAC-3′），位于NF-κB基因p65亞基mRNA的211bp-231bp

5、處，是特異的21個堿基的寡核苷酸靶序列區(qū)，應用在線RNAi軟件，此21堿基序列通過基因Blast(The Basic Local AlignmentSearch Tool)編碼為特異的短發(fā)夾狀RNA（short hairpin RNA，shRNA），并合成其互補核苷酸鏈，p65寡核苷酸鏈煺火形成雙鏈shRNA，然后將shRNA克隆到含有鼠源mU6啟動子的載體質粒pGenesil-1.2中，質粒多克隆位點中，SacI酶切位點位于HindⅢ

6、和mU6 promoter之間，構建的載體質粒含有抗卡那霉素基因，轉化大腸桿菌后能抵抗培養(yǎng)皿中卡那霉素，重組質粒轉染細胞后可形成shRNA，并在核糖核酸內切酶Dicer作用下形成有功能的siRNA，重組質粒為pGenesil-1.2 p65 siRNA表達載體質粒，用試劑盒行質粒DNA的轉化和擴增制備，經過專業(yè)公司:生工生物工程上海股份有限公司提取測序鑒定，即NF-κB p65 siRNA載體質粒用于本實驗研究。
　　二、體外細胞

7、學實驗:清潔級Wistar大鼠，購于山東大學醫(yī)學院動物實驗中心，體質量200g-300g，采用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，分離切取胸主動脈，游離血管平滑肌層，采用改良的組織塊貼壁法進行主動脈血管平滑肌細胞培養(yǎng)，將主動脈血管中膜組織剪斷成約1.5*1.5mm大小組織片，約3小時后等血管組織塊黏在培養(yǎng)瓶底部之后翻轉過來，1小時后加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于5％CO2，溫度為37℃的細胞培養(yǎng)箱中靜置，差異貼壁法純化細胞，常

8、規(guī)胰酶消化法傳代培養(yǎng)，用含20％胎牛血清DMEM/F12培養(yǎng)基孵育傳代培養(yǎng)至第4代使用，使平滑肌細胞貼壁，每3天換液一次，預防殘留組織中的成纖維細胞等去除部分雜質細胞成份，傳代時將消化吹打形成的細胞懸液靜置15分鐘，轉移培養(yǎng)至下一培養(yǎng)瓶中不斷靜置貼壁培養(yǎng)，重復后可獲得純度較高的平滑肌細胞。隨后將成功傳代培養(yǎng)的VSMC進行細胞轉染試驗研究，細胞隨機分為正常組（A組:即正常無處理組）;對照組（B組:空白質粒脂質體復合物處理組）和轉染組（C組

9、:NF-κB p65 siRNA質粒脂質體復合物轉染平滑肌細胞），使用倒置相差顯微鏡進行VSMC形態(tài)學觀察和免疫化學染色鑒定，并觀察VSMC轉染效果，流式細胞儀檢測細胞凋亡，MTT法檢測各組培養(yǎng)的VSMC增殖程度情況，WestemBlotting法檢測各組細胞NF-κB p65蛋白表達量的變化。
　　三、動物模型制作及動物實驗:NF-κB p65 siRNA載體質粒用于動物實驗研究，體質量約200g-300g左右的雄性Wistar

10、大鼠，制作大鼠自體頸外靜脈——腎下腹主動脈的血管移植模型，采用10％水合氯醛溶液3 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于手術板，頸部和腹部正中區(qū)域皮膚剃毛，消毒鋪無菌孔巾，頸部切口分離右側頸外靜脈主干并結扎其多余分支，應用套管法將靜脈兩端翻轉于18G靜脈留置針片段套管中，3/0細絲線固定，縫合頸部切口;大鼠腹部正中切口后，紗布分隔腸道組織，游離并用血管夾阻斷腎下腹主動脈，將翻轉于套管上的頸外靜脈遠心端套扎固定于腹主動脈近心端，同樣方法套扎吻合

11、動、靜脈另一端，開放血管夾后靜脈血管橋可見明顯血流充盈及搏動，依次縫合關腹。NF-κB p65 siRNA載體質粒用于動物實驗研究:其中雄性Wistar大鼠60只隨機分為A組:n=10，正常靜脈血管;B組:n=10，單純進行靜脈移植;C組:n=20，對照質粒脂質體復合物轉染移植靜脈血管橋和D組:n=20，基因轉染組采用NF-κB p65的siRNA質粒脂質體復合物轉染移植靜脈血管橋。移植靜脈血管橋的siRNA質粒脂質轉染:移植前采用si

12、RNA質粒脂質體復合物1ml浸泡沖洗切取的自體頸外靜脈血管20min、并30mmHg加壓灌注5min，靜脈血管橋吻合移植后血管外膜應用siRNA質粒脂質體復合物1ml涂抹轉染，術后相應時間取靜脈血管組織觀察血管壁內膜中膜形態(tài)學變化，測定內膜和中膜平滑肌厚度，免疫組化檢測移植血管組織增殖細胞核抗原(PCNA)水平，采用WesternBioting測定各組移植靜脈血管組織中NF-κB p65蛋白的表達水平，PCR測定血管壁組織中炎性因子MC

13、P-1和TNF-α的mRNA含量，其中PCR和WesternBloting測定過程中，內源性管家基因β-actin作為內參照，結果用于統(tǒng)計學分析。
　　結果:體外細胞學實驗成功培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC，形態(tài)學觀察可見平滑肌細胞呈特征性的峰谷狀樣生長，局部出現(xiàn)細胞聚集區(qū)，免疫化學染色鑒定VSMC，通過NF-κB p65siRNA質粒脂質體復合物轉染平滑肌細胞，WesternBloting測定細胞NF-κB p65蛋白，流式細胞儀檢測V

14、SMC細胞凋亡情況，以及MTT檢測平滑肌細胞增殖活性，結果顯示:C組與A、B組相比，其細胞的增殖活性明顯受到抑制，凋亡細胞比例明顯增多，增殖速度數(shù)量明顯降低，NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，但A組和B組之間無明顯差異。動物實驗研究中，各組血管組織中相關炎性因子PCR檢測結果以及WesternBloting蛋白測定結果提示，術后7d，B、C和D組血管橋組織中NF-κB p65蛋白的表達水平明顯高于A組靜脈組織，TN

15、F-α和MCP-1表達水平明顯大于A組(P＜0.05)，B組與C組結果之間無明顯差異，然而與C組相比，D組血管橋組織中NF-κB p65蛋白水平、炎性因子TNF-α和MCP-1的表達水平明顯降低(P＜0.05)，提示經過siRNA質粒脂質體復合物轉染處理后，D組血管橋組織NF-κB和炎性因子的表達受到明顯抑制。病理組織學研究中，血管橋管壁厚度測定和PCNA細胞免疫組化檢測結果可見:A組正常靜脈血管壁內膜和中層厚度較薄，平滑肌細胞數(shù)較少，

16、很少檢測到PCNA陽性細胞，靜脈移植術后14d，B、C組移植靜脈血管橋出現(xiàn)內膜和中層平滑肌明顯增厚，平滑肌細胞增殖活躍，大量PCNA陽性細胞主要集中于內膜及平滑肌層，動脈化程度較重，相對于B和C組血管橋，D組移植靜脈血管壁內膜和中層輕度增生，內膜厚度較小，PCNA陽性細胞數(shù)降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:通過siRNA載體質粒體外轉染VSMC，能夠有效阻斷NF-κB的炎性表達，減少平滑肌細胞NF-κB的激活，降

17、低炎性因子NF-κB，MCP-1、TNF-α的表達，增加細胞凋亡，抑制VSMC的增殖活性。動物實驗中，采用NF-κB p65 siRNA質粒脂質體復合物轉染移植靜脈，可以明顯抑制血管橋組織NF-κB的激活，降低炎性因子NF-κB，MCP-1和TNF-α的表達，減輕了血管壁炎癥反應，降低了移植靜脈血管內膜增生和VSMC增殖程度，體內和體外實驗揭示了炎性反應在靜脈移植后內膜增生中的重要作用，提示siRNA治療技術的有效性，為尋找有效、安全的