腺病毒介導(dǎo)NF-κB p65的siRNA抗大鼠移植肝缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、我國是世界上肝病發(fā)病率最高和因肝病導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的國家之一，同時也是接受肝移植治療的患者較多和肝移植發(fā)展較快的國家。肝移植后，肝臟無功能或肝衰仍然是一個重要的臨床問題。同時，移植器官的短缺迫使人們不得不采用一些邊緣供肝，而這些供肝對缺血再灌注損傷更敏感，使移植肝原發(fā)性功能障礙的發(fā)生率顯著提高，這在相當(dāng)程度上限制了肝移植的發(fā)展。如何避免這些損傷是目前肝移植研究領(lǐng)域的重點和熱點。 研究表明，肝移植缺血再灌注損傷過程中，NF—κB的

2、激活導(dǎo)致其下游基因—炎性介質(zhì)的大量表達，從而在移植后缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們可以設(shè)想抑制NF—κB的激活或表達有望調(diào)節(jié)或減輕缺血再灌注損傷。RNAi技術(shù)可以高效沉默特定基因，去除移植過程中不利基因的表達，在器官移植方面具有廣泛的應(yīng)用前景。有效的基因治療方案需要將目的基因穩(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)入移植物的細胞。腺病毒載體因具有嗜肝性、能夠轉(zhuǎn)染處于非增殖期的實質(zhì)細胞而在肝臟疾病研究方面具有優(yōu)勢。 第一部分、siRNA轉(zhuǎn)染B

3、RL細胞時轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化 目的：探討用RNAi—mate試劑轉(zhuǎn)染siRNA至BRL細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。 方法：設(shè)立不同的2種RNAi—mate量和4種siRNA量，交叉組合成8個不同比例的復(fù)合物，即8個實驗組，分別轉(zhuǎn)染接種培養(yǎng)的BRL細胞，24小時后，觀察細胞陽性轉(zhuǎn)染率和細胞存活率。 結(jié)果：siRNA的量為1．5ug，RNAi—mate為3．0ul時，其轉(zhuǎn)染效率為89%，細胞的生存率為84%，優(yōu)于其它條件時的轉(zhuǎn)染

4、效率并能保證相對小的細胞毒性。 結(jié)論：在本實驗中，用siRNA轉(zhuǎn)染BRL細胞，當(dāng)siRNA與RNAi—mate比例為1：2時，為最佳轉(zhuǎn)染條件。 第二部分、siRNA對BRL大鼠肝細胞NF—κB p65表達影響的研究 目的：篩選出能高效抑制NF—κB p65表達的siRNA序列。 方法：設(shè)計制備4對針對大鼠NF—κB p65的siRNA，結(jié)合對照共分為7個實驗組，采用研究一的轉(zhuǎn)染條件體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BRL細胞

5、，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blotting檢測siRNA的基因沉默效果。 結(jié)果：設(shè)計合成的4對siRNA均不同程度的從mRNA和蛋白表達水平抑制了BRL細胞NF—κB p65的表達，其中第二對siRNA mRNA和蛋白水平的抑制率分別為90%和80%。 結(jié)論：4對siRNA轉(zhuǎn)染BRL細胞后，均能發(fā)揮RNA干擾作用。第二對siRNA抑制效率最高。 第三部分、針對NF—κB p65的siRNA重組腺病毒的制

6、備及病毒包裝、擴增和滴度測定 目的：構(gòu)建針對NF—κB p65的siRNA重組腺病毒。 方法：將NF—κB p65 shRNA表達框插到穿梭質(zhì)粒pShuttle H1的啟動子下游，鑒定包含目的基因的正確克隆，將其線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy—1體外同源重組，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，篩選重組子并擴增。重組子線性化后，轉(zhuǎn)染293A細胞中進行病毒的包裝，同時大量擴增病毒，氯化銫密度梯度離心純化。重組腺病毒轉(zhuǎn)染BRL細胞檢測

7、NF—κB p65基因沉默效率。 結(jié)果：穿梭載體插入序列及重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定均完全正確。病毒擴增純化后滴度為3．0×10pfu/ml，并能在體外抑制NF—κB p65蛋白表達。 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對NF—κB p65的siRNA重組腺病毒。 第四部分、大鼠原位肝臟移植模型的建立 目的：用改良二袖套法建立穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型。 方法：在Kamada“二袖套法”的基礎(chǔ)上，在取肝、肝上下腔靜脈的

8、吻合、圍手術(shù)期處理等幾方面進行改良，共施行大鼠原位肝移植動物實驗140例，觀察術(shù)后并發(fā)癥及存活率。 結(jié)果：經(jīng)過140例次的訓(xùn)練，建立了穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型。在實驗的第三階段，受體無肝期平均12分鐘，手術(shù)成功率93%，兩周存活率90%。 結(jié)論：改良的二袖套法具有無肝期短、手術(shù)成功率高、大鼠術(shù)后存活時間長的優(yōu)點，是大鼠原位肝移植的理想術(shù)式。嫻熟細致的外科操作、受體無肝期的長短是決定動物存活的關(guān)鍵。 第五部分、A

9、d—shRNA—p65在大鼠移植肝缺血再灌注損傷中的保護作用 目的：觀測構(gòu)建的Ad—shRNA—p65腺病毒載體在大鼠體內(nèi)的基因沉默效果及其在大鼠原位移植肝缺血再灌注損傷中的保護作用。 方法：術(shù)前36小時將Ad—shRNA—p65通過門靜脈注入實驗組供體大鼠肝臟，3．0×109/只。移植術(shù)前處死一批大鼠，檢測血ALT、AST、LDH，肝臟病理，NF—κB p65的mRNA、蛋白表達。供肝獲取后冷保存4小時，改良的二袖套法

10、行原位肝臟移植術(shù)。門靜脈復(fù)流6小時后觀測受體膽汁分泌情況，處死受體大鼠，檢測血ALT、AST、LDH，肝臟病理，肝組織MDA水平，NF—κB p65的mRNA、蛋白表達以及免疫組化；TNF—α、MIP—2、ICAM—1mRNA表達，TNF—α的免疫組化，TUNEL法檢測肝臟細胞凋亡水平。 結(jié)果：移植術(shù)前，實驗組NF—κB p65的mRNA、蛋白表達降低，實驗組和空病毒組血生化指標(biāo)升高。術(shù)后6小時，實驗組膽汁分泌量多于對照組，血生

11、化指標(biāo)降低，MDA水平、NF—κB p65的mRNA、蛋白表達明顯低于對照組，TNF—α、MIP—2、ICAM—1mRNA低表達，實驗組細胞形態(tài)變化較輕，凋亡水平明顯低于對照組。 結(jié)論：構(gòu)建的腺病毒載體Ad—shRNA—p65能成功地轉(zhuǎn)染供肝，并有效沉默NF—κBp65表達，轉(zhuǎn)染本身對供肝可能有輕微的損害。Ad—shRNA—p65預(yù)處理的供肝能夠抑制移植肝缺血再灌注損傷引起的NF—κB p65激活和表達，并減輕移植肝的缺血再灌注