siRNA沉默F(xiàn)as基因減少大鼠肝移植冷保存和缺血再灌注損傷的研究.pdf

1、第一部分：Fas siRNA的設(shè)計、合成與篩選按sirNA的設(shè)計原則，設(shè)計和化學合成3個針對大鼠Fas的siRNA，對大鼠正常肝細胞(BRL細胞)傳代養(yǎng)后，轉(zhuǎn)染Fas siRNA，篩選高效抑制Fas表達的siRNA。 材料與方法：在Genebank中查找大鼠Fas mRNA序列((3enBank Accession No．NM139194)，應用Ambion公司的設(shè)計軟件，設(shè)計針對Fas mRNA的3對Fas siRNA序列：

2、 Fas siRNA1：175位點，正義鏈：5’GACAACAACUGCAGAA dAdC3'，反義鏈：3’dCdA GCUGUUGUUGAGAGUCUU 5'； Fas siRNA2：315位點，正義鏈：5’ACACGGACAGGAAACACUA dGdT 3'反義鏈：3’dTdG UGUGCCUGUCCUUUGUGAU 5'： Fas siRNA3：481位點，正義鏈：5'CACCUCGUGUGGACU

3、UGAA dTdG 3'．反義鏈：3'dGdT GUGGAGCACACCUGAACUU 5'。 同時合成陰性對照siRNA：正義鏈：5'UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3'；反義鏈3'dTdT AAGAGGCUUGCACAGUGCA 5'。 化學合成方法生產(chǎn)Fas siRNAs。 取液氮保存之大鼠BRL細胞株，傳代培養(yǎng)后用于轉(zhuǎn)染。 試驗分組：①空白對照組；②siRNA陰性對照組；③Fa

4、s siRNA 1組：④FassiRNA 2組；⑤Fas siRNA 3組。 3對Fas siRNA分別按50nmol/L的濃度轉(zhuǎn)染BRL細胞，作為Fas siRNA組，以陰性siRNA轉(zhuǎn)染細胞作為siRNA陰性對照組，非轉(zhuǎn)染細胞作為空白對照組。轉(zhuǎn)染前細胞培養(yǎng)基更換為Opti-MEM，在30 μl Opti-MEM中稀釋siRNA，50μlOpti-MEM中加入2μl Lipofectamine2000混合，將稀釋的siRNA

5、與稀釋的lipofectamine2000混合，室溫培養(yǎng)20min，然后將siRNA和Lipofectamine2000的混合液加入細胞培養(yǎng)孔中，搖晃孔板使充分混合。孵育48h后收集細胞，RT-PCR檢測Fas mRNA，Western blot檢測Fas蛋白。 采用SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法，對Fas mRNA進行相對定量檢測。使用管家基因GAPDH作為內(nèi)參，每一樣本的Fas mRNA相對量除以GAPDH

6、的相對量，即標準化，然后再用標準化值比較Fas mRNA在各樣本中轉(zhuǎn)錄水平的差異。Western blot檢測各轉(zhuǎn)染細胞Fas蛋白水平，同時檢測β-actin蛋白，作為內(nèi)參較正Fas蛋白定量。 數(shù)據(jù)處理：計量資料采用均數(shù)4-標準差(x±s)，進行單因素方差分析或予以一般統(tǒng)計學描述。數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用spss10.0軟件包，α設(shè)定為0.05。 本實驗共合成3對siRNA，轉(zhuǎn)染BRL細胞48h后，抽提總RNA進行RT-PCR檢測

7、Fas mRNA。3對siRNA均發(fā)揮了不同程度的干預效應(P<0.01)，干預效果由強至弱為：Fas siRNA2>Fas siRNA1>Fas siRNA3，F(xiàn)as mRNA相對表達量(Fas/GAPDH)分別低于空白對照組(69.3±7.8)﹪、(53.5±9.0)﹪和(45.0±8.9)﹪(P均<0.01)，以Fas siRNA2抑制效率最高。而陰性對照siRNA無干預作用，與空白對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

8、 Westem blot結(jié)果經(jīng)計算機灰度掃描并與內(nèi)參照(β-actin)比較分析顯示：轉(zhuǎn)染Fas siRNA后灰度比明顯減低，F(xiàn)as蛋白表達量分別低于空白對照(50±5)﹪、(75±7)﹪和(57±9)﹪(P均<0.01)，表明在蛋白水平Fas siRNA能顯著抑制Fas基因表達，蛋白表達變化與mRNA改變基本一致，F(xiàn)as siRNA2抑制效率最高。而siRNA陰性對照和空白對照相比無明顯蛋白表達改變。 第二部分：本實驗觀察

9、冷保存大鼠肝臟隨時程延長細胞凋亡及Fas基因表達在冷灌注保存肝臟組織中的變化，并探討通過水壓注射法轉(zhuǎn)染Fas siRNA對Fas基因表達進行抑制，能否減少冷灌注保存大鼠肝臟組織中的細胞凋亡。 材料與方法： 1、試驗對象：16周齡SD大鼠54只，體重200-250g，均為雄性。 2、水壓注射法轉(zhuǎn)染siRNA：每組大鼠18只，10﹪水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)陰莖靜脈按實驗分組注入配制好的實驗藥物，注射時間控制在15秒

10、左右。實驗分組：Fas siRNA組：注入200nmol/kg的Fas-siRNA(配入10﹪體重的磷酸鹽緩沖液(PBS)內(nèi))；siRNA陰性對照組：注入200nmol/kg的陰性對照siRNA(配入10﹪體重的PBS內(nèi))?？瞻讓φ战M：18只；僅注射10﹪體重的PBS。 3、大鼠供肝獲?。恨D(zhuǎn)染后48h，大鼠在乙醚麻醉下經(jīng)腹主動脈進行肝臟冷灌注取肝。 4、標本采集：冷保存2、4、6h后每組取6只供肝，取肝中葉進行相關(guān)檢測

11、。 5、檢測內(nèi)容：組織切片HE染色檢查、Fas免疫組化檢查、TUNEL染色檢測細胞凋亡、電鏡檢查，提取肝組織RNA行RT-PCR檢測Fas mRNA；組織勻漿抽提蛋白Western blot檢測Fas蛋白。 6、數(shù)據(jù)處理：計量資料采用均數(shù)士標準差(x±s)，采用方差分析，P<0.05時有顯著性差別。 結(jié)果： 1、所有大鼠都能安全接受水壓注射法轉(zhuǎn)染Fas siRNA。 2、TUNEL法檢測冷保存

12、大鼠肝組織肝臟組織中細胞凋亡，空白對照組的凋亡指數(shù)分別為2.40±0.29﹪、2.65±0.20﹪、6.65±0.38﹪，陰性siRNA對照組分別為2.25±0.31﹪、2.82±0.10﹪、7.60±0.29﹪。在2h、4h時，同組不同保存時間肝臟組織中凋亡細胞計數(shù)無顯著性差異，但當保存時間到6h時凋亡細胞增多(P<0.01)。Fas siRNA組各時點凋亡計數(shù)分別為2.27±0.22﹪、1.88±0.14﹪、1.97±0.15﹪，各

13、時點差別不明顯，2h、4h時與對照組相比無明顯差別，但6h時明顯低于對照組(P<0.01)。電鏡檢測、HE染色檢查發(fā)現(xiàn)Fas siRNA組的損傷較輕，細胞凋亡少。 3、在空白對照組和siRNA陰性對照組中，RT-PCR檢測2h、4hFas mRNA表達量無明顯差別，組間差別也不明顯，此時Fas siRNA組的表達量明顯較對照組低(P<0.01)；6h兩組對照組的。Fas mRNA表達量明顯增高(P<0.01)，組間差別不明顯，

14、而Fas siRNA組的Fas mRNA表達量仍無明顯增高，與對照組問的差別更明顯(P<0.01)。 4、在空白對照組和siRNA陰性對照組中，2、4h Fas蛋白量無明顯差別，組間差別不明顯，但Fas siRNA組的Fas蛋白量明顯較對照組低(P<0.01)；6h兩組對照組的Fas蛋白水平增高，組問差別不明顯，而Fas siRNA組的Fas蛋白水平仍無明顯增高，與兩組對照組間的差別更明顯(P<0.01)。在免疫組化檢測也可見

15、到Fas蛋白被Fas siRNA明顯下調(diào)。 第三部分：本試驗建立大鼠肝移植模型，探討針對大鼠Fas基因的siRNA，能否通過抑制Fas基因，減少肝移植缺血再灌注時的細胞凋亡，達到保護供肝的作用。 材料與方法：實驗動物：雄性SD大鼠150只，體重200-250g，分為三組，每組25對雄性SD大鼠。Fas siRNA組：供體大鼠經(jīng)陰莖靜脈注入200nmol/kg的Fas-siRNA(配入10﹪體重的PBS內(nèi))。siRNA對

16、照組：供體大鼠經(jīng)陰莖靜脈注入200nmol/kg的陰性對照siRNA(配入10﹪體重的PBS內(nèi))?？瞻讓φ战M：供體大鼠經(jīng)陰莖靜脈僅注射10﹪體重的PBS。轉(zhuǎn)染試驗后48h，將供體取肝進行原位肝移植手術(shù)。 肝臟復流后1、3、6、12、24h每組處死5只受體大鼠取材，經(jīng)下腔靜脈取血2 ml，送檢AST、ALT，作為肝細胞保存再灌注損傷的指標。 取肝中葉，其右半部分于-80℃保存?zhèn)溆?，行RT-PCR檢測Fas mRNA、W

17、estern blot檢測Fas蛋白；部分行HE染色、TUNEL染色、免疫組織化學染色檢測、電鏡檢測。 數(shù)據(jù)處理：實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 10.0對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。結(jié)果對照組與siRNA組肝移植再灌注后血清ALT、AST水平都逐漸升高，6h達到高峰，隨后逐漸下降。各時點siRNA組的血清ALT、AST水平明顯低于對照組。 TUNEL法和透視電鏡檢測細胞凋亡，可見在各時點所取的大鼠肝臟組織標一VII—本中