參附改善大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer細(xì)胞激活的研究.pdf

1、目的:1建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型,以適用于進(jìn)一步組織和細(xì)胞缺血再灌注損傷等方面的實(shí)驗(yàn)研究。2從組織水平上觀察SF對肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。3觀察參附(Shenfu,SF)注射液預(yù)處理對大鼠肝移植缺血再灌注后Kupffer細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor,GR)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)表達(dá)的影響以及KCs上清液腫瘤壞死因子α含量變化,探討參附預(yù)處理保護(hù)缺血再灌注損害(ischemia

2、reperfusion injury,IRI)的機(jī)制。
　　 方法:
　　 1根據(jù)Kamada經(jīng)典“二袖套法”建立大鼠原位肝移植模型,即應(yīng)用袖套法吻合肝下下腔靜脈(infrahepatic vena cava,IVC)和門靜脈(portalvenae,PV),肝上下腔靜脈(suprahepatic vena cava,SVC)吻合采用端對端連續(xù)縫合,以內(nèi)支撐管吻合膽管,肝動(dòng)脈不予吻合。
　　 2將雄性SD大鼠按完

3、全隨機(jī)分組法分為正常對照組、缺血再灌注組、SF組,其中缺血再灌注組、SF組建立肝移植缺血再灌注模型并與術(shù)后1,3,6,24h檢測各組血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)值,并于術(shù)后
　　 1周行肝組織病理學(xué)檢查。
　　 3按上述分組行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),于缺血再灌注后6h分離培養(yǎng)受體移植肝臟的Kupffer細(xì)胞。通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、蛋白免疫印記法(Western bloting)和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、免疫熒光法、酶聯(lián)

4、免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測Kupffer細(xì)胞GR的mRNA和蛋白表達(dá),NF-κB的蛋白表達(dá),培養(yǎng)上清中TNF-α的含量。
　　 結(jié)果:
　　 12010年3月到5月行預(yù)實(shí)驗(yàn)40例,后10例全部長期存活,一月生存率80％。在此基礎(chǔ)2010年6月到9月共行大鼠原位肝移植30例,手術(shù)成功率90%,一月生存率90%。供體手術(shù)、供肝修復(fù)、受體手術(shù)時(shí)

5、間分別為:35±2.5min、16±4.1和46+2.8min。無肝期≤19min,供肝冷保存時(shí)間≤60min。
　　 2術(shù)后正常對照組ALT為50.8±23.6。缺血再灌注組與SF組間比較,在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)比較均有差異,其中在3小時(shí)和6小時(shí)兩組ALT水平處于相對高峰期。缺血再灌注組3小時(shí)和6小時(shí)血清ALT分別為1075.01±134.02 U/L和958.15±35.70U/L;SF組3小時(shí)和6小時(shí)血清ALT分別為:808.79

6、±44.74U/L和655.55±69.18U/L,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05).
　　 3 RT-PCR、Western blot和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)、免疫熒光法、ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測顯示,缺血再灌注組Kupffer細(xì)胞GR mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于正常對照組(P＜0.01),缺血再灌注組NF-κB、培養(yǎng)上清TNF-α表達(dá)量(8.30.19±71.34)明顯高于正常對照組NF-κB、培養(yǎng)上清TNF-α表達(dá)量

7、(65.41±37.63,P＜0.01)。與缺血再灌注組相比,SF組GR水平明顯上升(P＜0.01),NF-κB活性、TNF-α表達(dá)量(543.59±41.27)明顯下降(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1 SF預(yù)處理能夠明顯降低肝移植大鼠的肝功能損害,改善ALT水平。同時(shí)從組織學(xué)層面上顯著改善術(shù)后移植肝臟的結(jié)構(gòu)破壞。
　　 2缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞GR的表達(dá)下調(diào),NF-κB的激活;參附預(yù)處