血紅素氧合酶-1對大鼠肝移植缺血再灌注損傷防護作用的實驗研究.pdf

1、肝臟移植(Livertransplantation，LTx)已成為終末期肝臟疾病的首選治療方法。然而，盡管在手術(shù)技術(shù)、器官保存和免疫抑制方面已經(jīng)取得較大進展，但原發(fā)性移植肝無功能(primarynon-function，PNF)和移植肝早期失功能依然是影響原位肝移植效果的重要因素。有5％～15％的患者因原發(fā)性移植肝無功能而導(dǎo)致移植肝功能衰竭而被迫再移植，同時還有10％～25％的患者移植后早期出現(xiàn)移植肝功能紊亂。研究表明，移植肝缺血再灌注

2、損傷是其重要原因，其不僅可使肝代謝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高，嚴重者還可導(dǎo)致肝功能衰竭。因此，減輕移植肝的缺血再灌注損傷是提高供肝質(zhì)量，減少PNF的發(fā)生，提高移植成功率的重點。 血紅素氧合酶(hemeoxygenase，HO)是一種催化血紅素降解為一氧化碳(carbonmonoxide，CO)、鐵和膽紅素的起始酶和限速酶。HO-1為誘導(dǎo)型，亦稱熱休克蛋白32(HSP32)。已證實HO-1是一種應(yīng)激蛋白，重金屬、熱休克、谷胱甘肽

3、耗竭、紫外線、內(nèi)毒素、缺血再灌注、缺氧、高氧等多種因素均可誘導(dǎo)HO-1的表達。近年來研究發(fā)現(xiàn)，外源性HO-1表達上調(diào)具有重要的抗炎癥和抗氧化作用，對動脈粥樣硬化、妊高癥、肺動脈高壓、組織損傷以及缺血再灌注損傷等具有防護作用，但關(guān)于其在肝移植缺血再灌注損傷中作用的研究尚較少見。因此，研究HO-1對肝移植缺血再灌注損傷的影響及其機制將為臨床肝移植缺血再灌注損傷的防護提供一條新的思路。 目的： 通過建立大鼠同種異體原位肝移植模

4、型，應(yīng)用HO-1的特異性誘導(dǎo)劑鈷原卟啉和抑制劑鋅原卟啉對實驗動物進行預(yù)處理，觀察其對移植肝缺血再灌注損傷的影響，并探討其可能機制，為臨床肝移植缺血再灌注損傷的防治提供一種可能的方法。 材料和方法： Wistar大鼠96只，體重200～250g，購自河南省實驗動物中心，隨機取6只為正常對照組(C組)，另90只隨機分為三組，即實驗1組(S1組)、實驗2組(S2組)和實驗3組(S3組)，每組30只。各實驗組隨機取供受體各12只

5、，供體在藥物預(yù)處理24h后行供肝切除術(shù)，其余6只作為供體僅行藥物預(yù)處理。各組預(yù)處理方法為：S1組按5ml/Kg經(jīng)腹腔注射生理鹽水，S2組按5mg/Kg注射鈷原卟啉，S3組按1.5mg/Kg注射鋅原卟啉。各實驗組均建立大鼠同種異體原位肝移植模型，4℃UW液灌注供肝至發(fā)白，切除供肝置于4℃UW液中保存，4h后行肝移植。各組分別在供體藥物預(yù)處理后24h、移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h自下腔靜脈抽取血樣，全自動分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(al

6、anineaminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartateaminotranferase，AST)的水平，放射免疫法檢測血清腫瘤壞死因子-a(tumornecrosisfactor-alpha，TNF-a)水平；切取部分肝臟組織，行HE染色觀察病理變化、免疫組織化學(xué)檢測HO-1蛋白的表達、RT-PCR法檢測HO-1mRNA的表達。C組不行肝移植，開腹后直接抽取下腔靜脈血及切取肝臟組織。記錄供肝冷缺血時間

7、，受體無肝期和受體手術(shù)時間。應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計分析系統(tǒng)，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析、單因素方差分析和t檢驗對全部數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，取a=0.05為顯著性檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果： (1)三組之間供肝冷缺血時間、受體無肝期和受體手術(shù)時間比較，差異無顯著性(P＞0.05)。 (2)與正常對照組相比，在供體預(yù)處理后24h，各實驗組血清ALT水平無顯著性差異(P＞0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實驗組血清ALT水平較

8、移植前明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0.05)；在門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組血清ALT水平明顯低于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯低于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (3)與正常對照組相比，在供體預(yù)處理后24h，各實驗組血清AST水平無顯著性差異(P＞0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實驗組血清AST水平較移植前明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0.

9、05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組血清AST水平明顯低于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯低于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (4)與正常對照組相比，在供體預(yù)處理后24h，各實驗組血清TNF-a水平無顯著性差異(P＞0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實驗組血清TNF-a水平較移植前明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0.05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組血

10、清TNF-a水平明顯低于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯低于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (5)供體預(yù)處理后24h，S2組即有HO-1蛋白陽性表達，位于肝竇內(nèi)皮細胞和Kupffer細胞，棕黃色顆粒散在于胞漿中，S1組和S3組只有極少量表達，C組則無表達，差異有顯著性(P＜0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實驗組HO-1蛋白表達水平較移植前明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，差異有顯著性(P＜0

11、.05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組HO-1蛋白表達水平明顯高于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1組明顯高于S2組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (6)供體預(yù)處理后24h，S2組可見肝臟組織中HO-1mRNA有較高表達，S1組和S3組只有極少量表達，C組無表達，差異有顯著性(P＜0.05)；移植肝門靜脈復(fù)流后1h，各實驗組HO-1mRNA水平較移植前明顯升高，且隨時間延長而逐漸升高，差異有顯著性(

12、P＜0.05)；在移植肝門靜脈復(fù)流后1h和3h，S2組HO-1mRNA表達水平明顯高于S1組(P＜0.05)和S3組(P＜0.05)，S1明顯高于S3組，差異有顯著性(P＜0.05)。 (7)HE染色發(fā)現(xiàn)，光鏡下各組在供體預(yù)處理后24h肝臟結(jié)構(gòu)正常；移植肝門靜脈復(fù)流后3h，S1組可見小片肝細胞中度濁腫，水泡樣變性，肝索增寬，肝血竇縮??；S2組僅出現(xiàn)肝竇輕度擴張；S3組可見肝索增寬，肝血竇變窄，大片肝細胞嚴重水泡樣變性，部分氣球樣