血紅素氧合酶-1-血管內(nèi)皮祖細(xì)胞途徑在血紅素結(jié)合蛋白改善大鼠局灶性腦缺血再灌注后認(rèn)知障礙中的作用.pdf

1、目的：
　　缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）損傷是缺血性腦卒中的重要發(fā)病基礎(chǔ)，可以破壞血管內(nèi)皮和引起血管內(nèi)皮功能障礙。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs）可分化成熟為血管內(nèi)皮，參與受損血管的修復(fù)和血管再生。血紅素結(jié)合蛋白（hemopexin, HPX）可以特異性的結(jié)合并清除多余的游離血紅素，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，而血紅素氧合酶-1（heme oxygena

2、se-1, HO-1）是該過程的限速酶。利用大鼠局灶性缺血再灌注損傷模型，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，HPX可以減輕大鼠缺血再灌注后的腦梗死面積，但是其具體機(jī)制并不甚清楚。本實(shí)驗(yàn)研究擬探討HO-1- EPCs途徑在HPX改善大鼠局灶性缺血再灌注后認(rèn)知功能障礙中的作用。
　　方法：
　　將雄性SD（Sprague–Dawley,SD）大鼠，7-8周齡，體重250-280g，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分為5組（n=20）:假手術(shù)（Sham）組

3、、局灶性缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion,MCAO）組、溶劑對(duì)照（MCAO+Vehicle）組、HPX治療（MCAO+HPX）組以及HO-1抑制劑鋅原卟啉Ⅸ（MCAO+HPX+ZnppIX）組。采用大腦中動(dòng)脈栓塞方法，制作大鼠局灶性缺血再灌注模型，生理鹽水、溶劑（Vehicle）疊氮鈉、HPX以及HO-1特異性抑制劑（zinc protoporphyrin IX， ZnppIX）均于缺血再灌注

4、后即刻經(jīng)側(cè)腦室注射(intracerebroventricular injection, i.v.)方式給予。HPX給予劑量為10μl(1.86μg/μl), MCAO組大鼠側(cè)腦室注射10μl生理鹽水（0.9％NaCl）, MCAO+Vehicle組大鼠側(cè)腦室注射10μl疊氮鈉（0.1%NaN3），MCAO+HPX+ZnppIX組大鼠側(cè)腦室給予10μl HPX和HO-1特異性抑制劑(zinc protoporphyrin IX， Znp

5、pIX)的混合液（HPX1.86μg/μl+0.1%NaN3）。
　　第一部分：側(cè)腦室注射HPX對(duì)大鼠局灶性缺血再灌注后行為學(xué)的影響。實(shí)驗(yàn)分為 Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX組和 MCAO+HPX+ZnppIX組,造模方法如上，造模前以及缺血再灌注后12h、24h、3d、5d、7d分別采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分(modified neurological severity scores， mN

6、SS)評(píng)價(jià)各組大鼠神經(jīng)功能損傷程度；采用Morris水迷宮（morris water maze,MWM）視頻采集系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠缺血再灌注后2-7 d的逃避潛伏期以及缺血再灌注后第7d時(shí)在目標(biāo)象限的時(shí)間百分比及穿過站臺(tái)次數(shù)。
　　第二部分：HO-1-EPCs途徑在HPX改善大鼠局灶性I/R后認(rèn)知障礙中的作用。首先，將實(shí)驗(yàn)分為Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX組，造模方法同第一部分。I/R后2h、6

7、h、12h、24 h和7d取各組大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction, RT-PCR）法檢測(cè)缺血半暗帶區(qū)腦組織中HO-1 mRNA的水平變化；利用蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(western blot)檢測(cè)大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織中HO-1蛋白質(zhì)的表達(dá)；然后將大鼠隨機(jī)分為 Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX組以及MCAO+HP

8、X+ZnppIX組，造模方法同第一部分，使用毛細(xì)采血管取各組大鼠內(nèi)眥球后靜脈叢血,通過流式細(xì)胞技術(shù)(flowcytometer, FC)鑒定和定量分析技術(shù)結(jié)合CD34/CD133雙抗體標(biāo)記技術(shù),檢測(cè)I/R后2h、6h、12h、24h、7d各組大鼠外周血中EPCs數(shù)量變化。
　　第三部分:側(cè)腦室注射HPX對(duì)大鼠局灶性I/R后缺血半暗帶區(qū)血管再生的影響。將大鼠隨機(jī)分為Sham組、MCAO組、MCAO+Vehicle組、MCAO+HPX

9、組以及MCAO+HPX+ZnppIX組，造模方法同第一部分，I/R后7d取各組大鼠冠狀面腦組織，即刻切腦組織冰凍切片。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合免疫熒光顯色技術(shù)檢測(cè)大鼠缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)以及紋狀體區(qū)的新生血管數(shù)量，了解EPCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化程度以及血管再生情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分：與 Sham組相比，局灶性缺血再灌注損傷可以明顯造成大鼠神經(jīng)功能缺損（p＜0.05），延長其逃避潛伏期（p＜0.05），減少其目

10、標(biāo)象限時(shí)間百分比和穿過站臺(tái)次數(shù)（p＜0.05）；側(cè)腦室注射HPX治療可以明顯減輕大鼠局灶性I/R后的神經(jīng)功能缺損（p＜0.05），縮短大鼠局灶性 I/R后在水迷宮中的逃避潛伏期（p＜0.05），增加大鼠在水迷宮中的目標(biāo)象限時(shí)間百分比和穿過站臺(tái)次數(shù)（均p＜0.05），提高其學(xué)習(xí)記憶能力；側(cè)腦室注射疊氮鈉對(duì)大鼠局灶性 I/R后的神經(jīng)功能缺損和學(xué)習(xí)記憶能力并無顯著影響（p＞0.05）；和HPX組大鼠相比，側(cè)腦室注射HPX的同時(shí)給予HO-1抑制

11、劑ZnppIX, HPX改善大鼠神經(jīng)功能缺損以及提高大鼠在水迷宮中的表現(xiàn)的作用消失（p＜0.05）。
　　第二部分：與 Sham組相比，局灶性缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)缺血半暗帶區(qū)的HO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平升高和其蛋白質(zhì)的表達(dá)增加（均p＜0.05），且在I/R后24h達(dá)到高峰，并使外周血中的EPCs數(shù)量增加（p＜0.05）；側(cè)腦室注射HPX治療可以顯著增加大鼠局灶性I/R后不同時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶區(qū)腦組織中的HO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)以及其

12、mRNA的轉(zhuǎn)錄水平（均p＜0.05），上調(diào)外周血中的EPCs數(shù)量（p＜0.05）；疊氮鈉側(cè)腦室注射對(duì)大鼠局灶性 I/R后不同時(shí)間點(diǎn)缺血半暗帶區(qū)腦組織中的HO-1的蛋白質(zhì)表達(dá)及其mRNA的水平和外周血中的EPCs數(shù)量無明顯影響（p＞0.05）。利用HO-1特異性抑制劑ZnppIX抑制HO-1的活性，可以逆轉(zhuǎn) HPX對(duì) EPCs的骨髓動(dòng)員到外周血的作用，使外周血中的 EPCs數(shù)量降低（p＜0.05）。
　　第三部分：與Sham組相比，

13、局灶性缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)d大鼠缺血再灌注后損傷后7d時(shí)缺血半暗帶區(qū)的血管再生（p＜0.05）；側(cè)腦室注射HPX可以明顯增加大鼠缺血半暗帶皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)以及紋狀體區(qū) I/R后的新生血管數(shù)量（p＜0.05）；疊氮鈉對(duì)大鼠缺血半暗帶區(qū)域的新生血管數(shù)量無顯著影響（p＞0.05）；ZnppIX可以抑制逆轉(zhuǎn) HPX促進(jìn)大鼠 I/R后缺血半暗帶區(qū)血管再生的作用（p＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　HPX可明顯減輕大鼠局灶性腦I/R損傷后