淋球菌PorB重組蛋白誘導(dǎo)THP-1分泌促炎細(xì)胞因子和細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建pGEX-6p-1/porB原核重組質(zhì)粒，表達(dá)并純化GST-PorB融合蛋白，分析重組PorB蛋白誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1）分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α及HMGB1的能力，并探討PorB蛋白對誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡作用的影響。
　　方法：從Genbank獲得PorB蛋白的全基因序列，設(shè)計(jì)引物，使用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PorB蛋白的基因序列，通過基因克隆技術(shù)將該段序列插入到pGEX-6p-1中，構(gòu)建pGE

2、X-6p-1/porB原核表達(dá)載體，以雙酶切及測序鑒定載體構(gòu)建是否成功。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入到制備好的Ecoli-BL-21感受態(tài)細(xì)菌中，誘導(dǎo)表達(dá)PorB蛋白，摸索最適誘導(dǎo)表達(dá)條件；通過尿素濃度梯度復(fù)性法對包涵體PorB蛋白進(jìn)行復(fù)性，使用GST-Bind?樹脂純化復(fù)性后的PorB蛋白。BCA法測定純化后的蛋白濃度，使用多粘菌素-B去除蛋白中的內(nèi)毒素，鱟試劑盒測定內(nèi)毒素含量。PorB蛋白經(jīng)過處理后分別以時(shí)間梯度和濃度梯度作用于THP-1細(xì)胞

3、，ELISA雙抗體夾心法分別檢測IL-1β、TNF-α和 HMGB1的產(chǎn)生水平；采用流式細(xì)胞術(shù)和AnnexinV-EGFP-PI雙染色法觀察不同時(shí)間和不同濃度的PorB蛋白對誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡作用的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)正確克隆porB基因，并將porB基因插入到pGEX-6p-1載體中，成功構(gòu)建了porB/pGEX-6p-1原核表達(dá)載體。
　　(2)摸索出重組蛋白的最適表達(dá)條件，即在30℃時(shí)，以0.2mM

4、 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)菌表達(dá)4h時(shí)，蛋白表達(dá)效果最好。經(jīng)純化后的重組蛋白，通過SDS-PAGE電泳，只出現(xiàn)大小為59KD左右的單一條帶，符合GST-PorB融合蛋白的預(yù)測值。
　　(3)分別以濃度為1，3，5，7，9μg/ml的重組porB蛋白處理THP-1細(xì)胞24h，在蛋白濃度為5μg/ml時(shí)，TNF-α，IL-1β和HMGB1分泌量達(dá)到最高峰，分別為（27.10±1.23）pg/ml，（109.44±3.53）pg/ml，（320

5、.09±9.67）pg/ml，與PBS/GST對照組及其它各濃度組比較具有顯著差異(P<0.05)。使用5μg/ml濃度的重組蛋白分別刺激THP-1細(xì)胞6，12，24，36，48h，TNF-α，IL-1β在刺激時(shí)間為36h時(shí)分泌量最高，分別為（39.94±2.35）pg/ml，（223.14±7.27）pg/ml，與其它各時(shí)間點(diǎn)組比較具有顯著差異(P<0.05)，而HMGB1分泌量從6h至48小時(shí)之間一直呈上升趨勢。
　　(4)分

6、別以濃度為1，3，5，7，9μg/ml的重組 porB蛋白濃度處理 THP-1細(xì)胞24h，通過AnnexinV-EGFP-PI熒光雙染法和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，在蛋白濃度為7μg/ml時(shí)，細(xì)胞凋亡情況最明顯，凋亡百分率為（23.13±2.01）％，與PBS/GST對照組及其它各濃度組比較具有顯著差異(P<0.05)；使用7μg/ml的蛋白處理細(xì)胞0，12，24，36，48h，結(jié)果顯示在24h時(shí)細(xì)胞凋亡率達(dá)到最高，為（20.75±2