去甲斑蝥素影響胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胰腺癌是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率高，預(yù)后差。目前尚無(wú)完全可靠有效的治療方法。已知腫瘤是一種細(xì)胞增殖與死亡障礙性疾病，腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制失常在惡性腫瘤的演進(jìn)過(guò)程中起重要作用。腫瘤防治的關(guān)鍵手段之一就是抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究探討傳統(tǒng)中藥的提取物去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)的相關(guān)凋亡基因Bcl-2、Caspase-3的影響變化情況，尋求其

2、作用效果及機(jī)制。 材料和方法: 1.人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)。去甲斑蝥素(norcan-tharidin，NCTD)由沈陽(yáng)藥科大學(xué)趙明宏博士饋贈(zèng)。流式細(xì)胞儀：美國(guó)Bec-ton Dickinson公司產(chǎn)的熒光激活分選儀(FACS)420型。免疫組化鼠抗人Bcl-2抗體、鼠抗人Caspase-3抗體購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。圖像分析儀器型號(hào)：MetaMorph/DPIO/BX41；生產(chǎn)廠：UIC/OL

3、YMPUS，US/JP。圖象分析軟件：1 D Kodar成像分析系統(tǒng)。 2.培養(yǎng)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株并傳代。 3.體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：①以NCTD濃度為橫軸、吸光值為縱軸，繪制藥物濃度曲線，求50％抑制率對(duì)應(yīng)的藥物濃度即為半數(shù)抑制濃度IC50。②NCTD對(duì)AsPC-1細(xì)胞的抑制率為：抑制率=(l-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100％。找出NCTD抑制作用最明顯的時(shí)間。 4.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：①一般形態(tài)學(xué)觀察。②超

4、微結(jié)構(gòu)觀察。 5.流式細(xì)胞術(shù)：檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率。 6.Western blot：分別收集對(duì)照組(n=6)和實(shí)驗(yàn)組(n=6)胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。以β-actin為內(nèi)對(duì)照。照片用1D Kodar圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值半定量分析，以相應(yīng)蛋白條帶的平均光密度值來(lái)表示Capase-3的表達(dá)程度。 7.胰腺癌裸鼠模型建立，裸鼠種植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)：荷瘤鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(n=8)、NCTD組

5、(n=8)、5-FU組(n=8)、NCTD+5-FU聯(lián)合用藥組(n=8)4組，各組用藥前裸鼠體重和瘤體大小無(wú)差異。從種植AsPC-1細(xì)胞后第2周始，分別自腹腔注射生理鹽水、5-FU(24mg/kg，)、NCTD(28mg/kg)、5-FU(24mg/kg)+NCTD(28mg/kg)，每周2次，共6周。 8.荷瘤裸鼠標(biāo)本免疫組化處理：荷瘤鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(n=8)、NCTD組(n=8)。用藥前2組裸鼠體重和瘤體大小無(wú)差異。從種植

6、AsPC-1細(xì)胞后第2周始，分別自腹腔注射生理鹽水、NCTD(28mg/kg，每周2次，共6周。待第7周以頸椎脫位法處死裸鼠，切取種植瘤標(biāo)本固定、切片。 Bcl-2免疫組化處理，封片后在光鏡下觀察。根據(jù)細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃染物質(zhì)的光密度判讀結(jié)果，隨機(jī)框取相同放大倍數(shù)與面積的細(xì)胞區(qū)域，采用MetaMor-ph/DP10/BX41型圖象分析系統(tǒng)測(cè)定其相對(duì)光密度。 結(jié)果： 1.NCTD濃度為10μg/ml時(shí)，對(duì)AsPC-1

7、的生長(zhǎng)有抑制作用，且隨藥物濃度升高其抑制作用增強(qiáng)，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；NCTD作用6h后對(duì)AsPC-1生長(zhǎng)具有抑制作用，48 h時(shí)抑制作用最明顯，呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)NCTD作用后，流式細(xì)胞儀顯示：G2+M期的細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞凋亡率上升；光鏡檢查顯示：AsPC-1可出現(xiàn)細(xì)胞固縮，胞膜突出，核碎裂等現(xiàn)象；電鏡顯示：細(xì)胞微絨毛卷縮、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器衰退，并可見(jiàn)典型的凋亡小體。 2.20μg/ml的NCTD液

8、作用于體外培養(yǎng)的人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞48h.Western blot分析顯示實(shí)驗(yàn)組Caspase-3的表達(dá)顯著增加(P<0.05)；裸鼠移植瘤切片經(jīng)免疫組化分析，實(shí)驗(yàn)組Bc1-2的表達(dá)顯著減少(P<0.01)。 3.NCTD可使裸鼠種植瘤明顯縮小(2.22±0.18 Vs.3.25±0.18 cm3，P<0.01)，抑瘤率增高(31.69％vs.0，P<0.05)；種植瘤細(xì)胞周期中G2+M期細(xì)胞百分率明顯增多(51.24±1

9、.92 Vs.23.31±1.81，P<0.01)，凋亡率上升(0.23±0.05 vs.4.21±0.52，P<0.01)；與5-FU合用時(shí)上述作用更明顯。NCTD作用后的種植瘤細(xì)胞經(jīng)光鏡檢查見(jiàn)胞核固縮，核碎裂等現(xiàn)象；電鏡顯示典型的凋亡細(xì)胞及凋亡小體。 結(jié)論： 1.NCTD能抑制人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)，其作用呈劑量、時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。其機(jī)制可能與NCTD誘導(dǎo)AsPC-1細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，干擾細(xì)胞生長(zhǎng)周期，抑