去甲斑蝥素抑制人乳腺癌SKBR3細(xì)胞增殖及侵襲轉(zhuǎn)移的體外研究.pdf

1、研究背景與目的：乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的重要原因，也是臨床治療的難題。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)嚴(yán)格有序的過(guò)程，趨化因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色，包括控制白細(xì)胞浸潤(rùn)至腫瘤、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)血管生成、激活宿主對(duì)腫瘤的特異性免疫應(yīng)答、以自分泌或旁分泌方式刺激腫瘤細(xì)胞增殖、控制腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。CXCR4在人類乳腺癌細(xì)胞，惡性乳腺腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶均高度表達(dá)，與SDF-1(CXCL12)相互作用嚴(yán)格調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)及與血管內(nèi)皮的黏附能力

2、等。Ras基因在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的調(diào)控中起重要作用，參與信號(hào)傳導(dǎo)通路、細(xì)胞周期檢控、細(xì)胞增殖分化調(diào)節(jié)和凋亡的抑制。乳腺癌中，Ras家族H-ras、Rhoc GTPase基因水平與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。阻斷或下調(diào)CxCR4與ras信號(hào)傳導(dǎo)通路均是有效的抗腫瘤治療策略，也是抗腫瘤藥物研發(fā)熱點(diǎn)。 外科手術(shù)是治療大多惡性腫瘤首選方法，但對(duì)于已轉(zhuǎn)移，易復(fù)發(fā)或晚期癌癥，藥物治療(化療)通常是抵御和預(yù)防惡性腫瘤的有力武器。但化療伴隨

3、的毒副作用對(duì)患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生不可忽視的影響，因而當(dāng)前臨床治療的方向就是那些有選擇性地抑制腫瘤細(xì)胞而對(duì)人體正常細(xì)胞沒(méi)有毒性或低毒性，對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)影響小的抗腫瘤藥物。中醫(yī)中藥治療腫瘤為我國(guó)的特色，具有獨(dú)特的機(jī)制與效應(yīng)，去甲斑蝥素(Norcantharidin，NCTD)具有傳統(tǒng)中藥斑蝥素顯著的抗癌活性，可在細(xì)胞毒、誘導(dǎo)凋亡、抗粘附轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管生成等多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮抗癌作用。對(duì)肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，且心腎毒、副作用較低，并

4、有刺激骨髓造血系統(tǒng)使白細(xì)胞升高，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，具有廣闊的應(yīng)用前景。去甲斑蝥素可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但是否能抑制乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的研究國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道，其抗癌機(jī)制是否與其它腫瘤一致；NCTD是否也能通過(guò)CXCR4和/或H-ras信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移作用，尚需進(jìn)一步研究探討。本課題主要探討去甲斑蝥素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的粘附和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的影響，揭示去甲斑蝥素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為該藥在臨床乳腺

5、癌侵襲轉(zhuǎn)移的防治提供藥理方面理論。 方法：體外培養(yǎng)人乳腺癌SKBR3細(xì)胞株，采用MTT法檢測(cè)NCTD對(duì)乳腺癌細(xì)胞SKBR3生長(zhǎng)增殖的抑制能力；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)NCTD對(duì)SKBR3細(xì)胞周期和凋亡的影響；應(yīng)用腫瘤細(xì)胞體外粘附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)和Transwell體外侵襲轉(zhuǎn)移模型檢測(cè)NCTD對(duì)SKBR3細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用。通過(guò)RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)、westem-blot等方法研究乳腺癌細(xì)胞CXCR4、H-ras增殖和表達(dá)，

6、揭示NCTD對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)遷移能力影響的分子機(jī)制。 結(jié)果：NCTD可抑制人乳腺癌SJBR3細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，24h的IC<,50>為12.5μg/mL。呈明顯的劑量和時(shí)間依賴性；NCTD 10μg/mL作用SKBR3細(xì)胞24h、48h后，特異地使SKBR3細(xì)胞發(fā)生G<,2>/M期阻滯，G<,2>/M期細(xì)胞百分比分別為35.82﹪、38.7﹪，G<,1>期和S期細(xì)胞較對(duì)照組明顯減少，亞G<,1>和G<,0>峰DNA含量逐漸

7、增加，24h、48h的凋亡率分別為3.44﹪和116.17﹪；SKBR3細(xì)胞的體外粘附、運(yùn)動(dòng)、侵襲轉(zhuǎn)移能力隨NCTD藥物濃度提高而下降，表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)改變，粘附抑制率增加，過(guò)河時(shí)間延長(zhǎng)，過(guò)膜細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù),western-blot結(jié)果顯示，10μg/mL NCTD作用SKBR3后，H-ras mRNA和ras P21蛋白水平表達(dá)明顯下降，且48h組遠(yuǎn)低于24h和對(duì)照組(P<0.05)；而藥物組CXC

8、R4 mRNA及蛋白水平則有表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，24h升高，48h又趨下降，與對(duì)照組相比，差別無(wú)顯著性意義(P>0.05)。 結(jié)論： 1.證實(shí)去甲斑蝥素有效抑制乳腺癌SKBR3細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。 2.證實(shí)去甲斑蝥素有效抑制乳腺癌SKBR3細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)成分粘附，侵襲和轉(zhuǎn)移。 3．證實(shí)去甲斑蝥素可通過(guò)下調(diào)H-ras基因的表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移。為拓展去甲斑蝥素成為臨床抗乳腺癌