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文檔簡介
1、研究背景和目的: 近年來我國乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),死亡率也在不斷攀升,特別是京、津、滬等發(fā)達(dá)城市以及沿海的一些省份。雖然目前對(duì)乳腺癌的治療已經(jīng)取得了明顯的進(jìn)展,但遠(yuǎn)未達(dá)到根治乳腺癌目的,經(jīng)過綜合治療后乳腺癌仍然可能復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。這主要是因?yàn)?,目前用于控制?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的手段主要依賴于放療和化療以及內(nèi)分泌治療,而藥物通常只是作用于增生活躍的癌細(xì)胞,對(duì)處于靜息期的癌細(xì)胞以及構(gòu)成腫瘤生長微環(huán)境的間質(zhì)成分則作用不大。而這些間質(zhì)成分則是日后腫
2、瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的根源。 構(gòu)成腫瘤生長微環(huán)境的間質(zhì)成分包括維持腫瘤生長和作為日后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移途徑的血管;包括分泌細(xì)胞外基質(zhì)、為腫瘤的生長提供了支架的成纖維細(xì)胞;此外還有巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞及這些細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子和化學(xué)介質(zhì)。在這些間質(zhì)成分中,巨噬細(xì)胞作為一種功能多樣化的細(xì)胞,可以通過多種途徑影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前研究認(rèn)為,體內(nèi)的單核細(xì)胞主要存在兩種活化方式,一種是以細(xì)菌脂多糖(1ipopolysacc
3、haride,LPS)或γ-干擾素(interferon-γ,INF-γ)誘導(dǎo)的經(jīng)典激活(classicalactivation),經(jīng)典激活的單核細(xì)胞主要以表達(dá)TNF-α為標(biāo)志;一種是以Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素4(interlukin-4,IL-4)等誘導(dǎo)的替代激活(alternativeactivation),替代激活的單核細(xì)胞主要以表達(dá)巨噬細(xì)胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子-1(Altemative Macrophage Activatio
4、n-Associated CC.Chemokine-1,AMAC-1)為標(biāo)志。那么這兩種激活狀態(tài)的單核細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞到底有什么影響?與腫瘤中的巨噬細(xì)胞即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM的作用有無相似之處?故此我們以人外周血單核細(xì)胞為研究對(duì)象,采用LPS、IL-4在體外分別刺激單核細(xì)胞向不同的功能狀態(tài)分化,觀察不同活化狀態(tài)的單核巨噬細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長侵襲的影響。進(jìn)而探討TAM在腫瘤發(fā)展中可能的作用機(jī)制。 方法: 1.人外周血單核細(xì)
5、胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)活化取健康成人外周血100-200ml,肝素抗凝處理后,PBS溶液等倍稀釋,采用密度梯度離心法分離得到單個(gè)核細(xì)胞,PBS洗滌,接種于六孔培養(yǎng)板內(nèi)在37℃、5﹪C O 2條件下孵育1 h,反復(fù)洗去懸浮的淋巴細(xì)胞,得到貼壁的單核細(xì)胞。用含10﹪胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3-5天,根據(jù)激活介質(zhì)的不同將其分為三組:LPS組、IL-4組、培養(yǎng)基空白對(duì)照組,每組5個(gè)復(fù)孔.
6、分別加入LPS(終濃度25u個(gè)/ml),IL-4(終濃度15ng/ml),對(duì)照組不任何介質(zhì),37℃、5﹪C O 2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后監(jiān)測(cè)相應(yīng)分子標(biāo)志物及進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。 2.采用RT-PCR監(jiān)測(cè)不同激活狀態(tài)的單核細(xì)胞分子標(biāo)志物mRNA的表達(dá)差異分別消化收集經(jīng)不同介質(zhì)處理48-72 h的單核細(xì)胞,用TRIzol.一步法提取總RNA,以RT-PCR檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞經(jīng)典激活分子標(biāo)志物TNF-α、替代激活分子標(biāo)志物AMAC-
7、1以及分子內(nèi)參照β-actin mRNA的表達(dá),產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在UVI凝膠成像系統(tǒng)下成像觀察各組間表達(dá)差異,Gel pro analyser3.2軟件做半定量分析瓊脂糖凝膠電泳圖。各組細(xì)胞因子與β-actin條帶的灰度比(TNF-α/β-actin,AMAC-1/β-actin)作為各細(xì)胞因子mRNA的相對(duì)表達(dá)豐度,結(jié)果以x±s表示。 3.共培養(yǎng)觀察不同活化狀態(tài)的單核細(xì)胞對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SKBR3生長侵襲的影響.將SKB
8、R3細(xì)胞與經(jīng)過相關(guān)因子處理48小時(shí)后的單核細(xì)胞消化后分別接種于Transwell(濾膜孔徑0.4um)內(nèi)小室中和外室進(jìn)行共培養(yǎng),按單核細(xì)胞處理因素的不同分為LPS組、IL-4組、未激活組以及不含單核細(xì)胞的空白對(duì)照組,在共培養(yǎng)體系下共進(jìn)行如下三個(gè)方面的試驗(yàn):每24小時(shí)采用MTT法監(jiān)測(cè)SKBR3細(xì)胞的生長情況,共5天,觀察不同激活的單核細(xì)胞對(duì)SKBR3生長曲線的影響;共培養(yǎng)24小時(shí)后,采用氚標(biāo)記脫氧嘧啶核苷酸(3H-TdR)摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同
9、激活狀態(tài)的單核細(xì)胞對(duì)SKBR3的攝取3H-TdR的影響;采用細(xì)胞劃痕法觀察單核細(xì)胞對(duì)SKBR3乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響。 4.建立雞胚尿囊膜血管生成模型觀察不同活化狀態(tài)的單核細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)新生血管生成的影響將3日齡健康江高黃雞雞胚消毒后置于超凈臺(tái)中,卵殼開窗,剪除卵膜,暴露血管豐富的尿囊膜,接種細(xì)胞于尿囊膜兩大血管之間的相對(duì)無血管區(qū),分五組:RPMI-1640培養(yǎng)基空白對(duì)照組、單純SKBR3細(xì)胞組、未激活單核細(xì)胞+SKBR
10、3組、經(jīng)典激活單核細(xì)胞+SKBR3組、替代激活單核細(xì)胞+SKBR3組,每組10只,封閉窗口,將雞胚置于溫度37.5℃,濕度50﹪的恒溫箱中繼續(xù)孵育至10日齡,滴加10﹪的福爾馬林殺死雞胚并固定尿囊膜組織,將尿囊膜組織平鋪于載玻片上并加蓋蓋玻片后置于四倍解剖顯微鏡下觀察并拍照,選取清晰的照片記錄匯聚血管的數(shù)量,數(shù)據(jù)以x±s表示,分析三種不同活化狀態(tài)的單核巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的影響。 結(jié)果: 1.RT-PCR監(jiān)測(cè)不
11、同激活狀態(tài)的單核細(xì)胞分子標(biāo)志物mRNA的表達(dá)情況LPS激活的單核細(xì)胞明顯高表達(dá)TNF-α,低表達(dá)AMAC-1;IL-4激活的單核細(xì)胞則高表達(dá)AMAC-1,低表達(dá)TNF-α;而未分化的單核細(xì)胞則兩種細(xì)胞因子均有低表達(dá)。將瓊脂糖凝膠電泳圖中各組TNF-α,AMAC-1條帶平均灰度值與β-actin平均灰度值比較進(jìn)行半定量分析,結(jié)果顯示:經(jīng)典激活的單核細(xì)胞其TNF-α的表達(dá)均明顯高于替代激活的單核細(xì)胞及培養(yǎng)基對(duì)照組(P<0.05);替代激活的
12、單核細(xì)胞其表達(dá)的AMAC-1也明顯的高于其他兩組,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均存在差異(P<0.05)。 2.不同激活狀態(tài)的單核巨噬細(xì)胞對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株SKBR3生長、代謝、遷移的影響通過將不同活化狀態(tài)的單核巨噬細(xì)胞同乳腺癌細(xì)胞SKBR3共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)LPS經(jīng)典激活的單核細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯抑瘤效應(yīng),3天后曲線明顯低于其它3組(P<0.05),隨時(shí)間的推移愈加明顯;IL-4替代激活的單核細(xì)胞則在第5天開始呈現(xiàn)出明顯促腫瘤效應(yīng)高于單純培養(yǎng)劑對(duì)照組與經(jīng)
13、典激活組(P<0.05)。與未激活組無名顯差別。未激活組在共培養(yǎng)的過程中也呈現(xiàn)出促腫瘤生長的趨勢(shì),明顯高于經(jīng)典激活組,但與單純培養(yǎng)基組對(duì)照組之間但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異在代謝實(shí)驗(yàn)中,各組SKBR3對(duì)3H-TdR的攝取自30分鐘開始逐漸增強(qiáng),2小時(shí)后漸趨平穩(wěn)。各組中以替代激活組的SKBR3攝取最強(qiáng),其余個(gè)組水平依次為未激活組、對(duì)照組、經(jīng)典激活組。替代激活的單核細(xì)胞對(duì)3H-TdR的攝取,2h顯著高于對(duì)照組(P=0.017);30min、2h
14、顯著高于經(jīng)典激活組(P=0.001;P=0.0003):各時(shí)點(diǎn)雖然也高于未激活組,但缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而經(jīng)典激活組SKBR3在30分鐘時(shí)的攝取率則明顯低于未激活組(P=0.014),2h,4h也低于未激活組,但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07,P=0.08)。以及2h低于對(duì)照組(P=0.01),其余各時(shí)點(diǎn)雖然也低于對(duì)照組,但是缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。效應(yīng)指數(shù)分析顯示,替代激活單核細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)上表現(xiàn)出的均為正效應(yīng)(>1),而經(jīng)典激活的單核細(xì)胞則均為
15、負(fù)性效應(yīng)(<1)。未激活的單核細(xì)胞其作用類似于替代激活的單核細(xì)胞。 在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中,替代激活以及未激活的單核細(xì)胞在共培養(yǎng)時(shí)能夠明顯增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移力,經(jīng)典激活的單核細(xì)胞則可以抑制單核細(xì)胞的遷移。 通過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)不同激活狀態(tài)的單核細(xì)胞對(duì)于乳腺癌細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的影響是不同的,這種影響可以通過非細(xì)胞接觸的方式來實(shí)現(xiàn),反過來乳腺癌細(xì)胞也可以通過細(xì)胞問的介質(zhì)誘導(dǎo)單核細(xì)胞向替代激活的方向分化。 3.不同激活狀態(tài)的單核巨噬
16、細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞株SKBR3誘導(dǎo)腫瘤血管生成的影響在不同激活的單核巨噬細(xì)胞存在的情況下,各組乳腺癌細(xì)胞誘導(dǎo)生成的腫瘤新生血管以接種部位為中心,呈匯聚生長。經(jīng)4倍光學(xué)顯微鏡下對(duì)新生的匯聚血管進(jìn)行計(jì)數(shù)量化處理,以x±s表示。以各組平均新生血管的數(shù)量按從多到少的順序依次為:IL-4激活的單核細(xì)胞(57±14)、未激活組的單核細(xì)胞(32±8)、LPS激活的單核細(xì)胞(20±6)、單純癌細(xì)胞組(14±6)。替代激活的單核細(xì)胞組對(duì)腫瘤細(xì)胞新生血管誘導(dǎo)
17、生成的能力明顯高于其他各組,統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異(P<0.05),而空白培養(yǎng)基對(duì)照組無匯聚血管的形成。 結(jié)論: 單核細(xì)胞可以被不同的細(xì)胞因子誘導(dǎo)向不同的活化方向分化;不同活化的單核細(xì)胞各自表達(dá)不同的分子標(biāo)志物,經(jīng)典激活的單核細(xì)胞表達(dá)TNF-α,替代激活的單核細(xì)胞表達(dá)AMAC-1;在體外共培養(yǎng)的情況下替代激活的單核細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、代謝及遷移能力,而經(jīng)典激活的單核細(xì)胞則可以抑制腫瘤生長、代謝以及遷移。腫瘤細(xì)胞還
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