骨橋蛋白介導甲狀腺相關眼病發(fā)病機制的研究.pdf

1、目的：
　　甲狀腺相關眼病(thyroid associated ophthalmopathy，TAO)是彌漫性毒性甲狀腺腫(Graves' disease，GD)最常見的甲狀腺外表現(xiàn)，是累及眼眶的一種自身免疫性炎癥性疾病。TAO具體發(fā)病機制十分復雜，至今仍不十分清楚，目前仍缺乏有效性治療手段。目前證據(jù)表明眼眶成纖維細胞（orbital fibroblasts，OFs）在TAO發(fā)病機制中起核心作用，參與TAO眼眶炎癥、組織重塑和纖

2、維化等多種病理過程。骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)是一種分泌型磷酸化糖蛋白，在一些自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，具有多種生物學效應，可誘導成纖維細胞增殖，并且和組織纖維化有密切關系，最近研究發(fā)現(xiàn)，GD患者血清中OPN水平明顯增高。為了探究OPN和TAO發(fā)病的關系，首先擬檢測TAO眼眶脂肪結締組織中OPN mRNA和蛋白表達情況，相關細胞因子mRNA表達情況以及和OPN mRNA表達量之間的關系。然后進行細胞實驗，用OPN刺激

3、TAO患者來源OFs，觀察OPN對OFs增殖、移行以及對VEGF和CollagenⅠ mRNA表達量的影響并探究其相關機制。
　　方法：
　　1.OPN在TAO患者眼眶脂肪結締組織中的表達情況
　　活動期或穩(wěn)定期TAO患者行眼眶減壓手術時，取眼眶脂肪結締組織，用行眼整形手術患者的正常眼眶脂肪結締組織作為對照組，每組6例。實時熒光定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）法和Western blotting法

4、分別檢測OPN mRNA和蛋白表達情況。然后通過RT-PCR檢測相關細胞因子包括CD40L、CollagenⅠ、HAS2、NF-κB、CCL20、CD44、IFN-α和IFN-γ mRNA表達情況，并和OPN mRNA表達量進行相關性分析。
　　2.OPN對TAO患者OFs的影響及其作用機制探討
　　排除其它免疫性及炎癥性疾病的TAO患者，行眼眶減壓手術時，無菌條件下取眼眶脂肪結締組織，組織塊法培養(yǎng)OFs細胞。用OPN(5u

5、M)進行預處理后，采用MTT法觀察OFs增殖速率，并通過細胞劃痕實驗觀察OPN對OFs移行的影響，再通過RT-PCR法檢測OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表達量。
　　同法培養(yǎng)OFs細胞，用PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002(20uM)、MAPK/ERK信號通路抑制劑PD98059(20uM)、LY294002和PD98059(20uM+20uM)以及OPN單克隆抗體1A12(20μg/ml)分別聯(lián)合OP

6、N對OFs進行預處理，通過MTT法、細胞劃痕實驗和RT-PCR法分別觀察對OFs增殖、移行速率的影響，并檢測OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表達量的變化。
　　結果：
　　1.活動期TAO患者眼眶脂肪結締組織OPN mRNA和蛋白表達量及相關細胞因子mRNA表達量升高
　　活動期TAO患者組眼眶脂肪結締組織中OPN mRNA比穩(wěn)定期TAO患者組和正常對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);OPN

7、蛋白表達量也明顯增加，和穩(wěn)定期TAO患者OPN蛋白表達量相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，但和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　活動期TAO患者組眼眶脂肪結締組織中CD40L、CollagenⅠ mRNA表達量比穩(wěn)定期TAO患者組和正常對照組高，存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05); HAS2 mRNA表達量也升高，但和穩(wěn)定期TAO患者組和正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);活動期和穩(wěn)定期TAO患者組

8、CD44 mRNA表達量均低于正常對照(P＜0.05)。TAO患者OPN mRNA表達量和CD40L、CD44、HAS2 mRNA表達量之間存在明顯的線性相關關系(P＜0.05)。
　　2.OPN可促進OFs的增殖、移行速率，并增加VEGF和CollagenⅠ mRNA表達量。
　　經(jīng)過OPN處理后，OFs增殖和移行速率加快，加入1A12和LY294002后，OFs增殖和移行速率變慢，而加入PD98059后對這些效應無明顯影

9、響。
　　經(jīng)OPN預處理后，OFs的VEGF和CollagenⅠ mRNA表達量明顯增加，加入1A12和LY294002后，VEGF和CollagenⅠ mRNA表達量降低，加入PD98059后對兩種基因mRNA表達量無明顯影響。
　　結論：
　　活動期TAO患者眼眶脂肪結締組織OPN mRNA和蛋白表達水平明顯升高，同時CD40L、CollagenⅠ和HAS2 mRNA表達量也增加，且CD40L、CD44、HAS2m