吸煙在甲狀腺相關(guān)性眼病氧化應(yīng)激中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　甲狀腺相關(guān)性眼病是眼眶病中較常見的一種，且發(fā)病率逐漸上升，可引起外觀及視功能的損傷，臨床表現(xiàn)多樣，疾病后果嚴(yán)重，具體發(fā)病原因不明確，故近年來一直是困擾眼科醫(yī)生的難題。而吸煙被證明是甲狀腺相關(guān)性眼病(TAO)的重要危險因素，另外，有研究發(fā)現(xiàn)吸煙與氧化應(yīng)激存在相關(guān)性，而我們已知氧化應(yīng)激在TAO的疾病過程中發(fā)揮著重要作用。香煙的成分十分復(fù)雜，其中公認(rèn)的毒性成分為尼古丁，目前國內(nèi)外在其他疾病方面針對吸煙的研究多采用香煙煙霧提取

2、物(CSE)及尼古丁兩種物質(zhì)為刺激因素，眼眶成纖維細(xì)胞作為TAO的最終效應(yīng)細(xì)胞，是近年來TAO相關(guān)研究的經(jīng)典研究模型。故本研究采用原代培養(yǎng)的眼外肌來源眼眶成纖維細(xì)胞，研究香煙煙霧提取物及尼古丁作用于TAO患者及正常人眼眶成纖維細(xì)胞后，各種氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、MDA、8-OHdG的變化，探索香煙煙霧提取物及尼古丁在TAO這一疾病中是否通過氧化應(yīng)激發(fā)揮作用，其具體的劑量關(guān)系，并通過檢測香煙煙霧提取物及尼古丁對于眼眶成纖維細(xì)胞NF-kB通路的

3、作用來進(jìn)一步探索其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1、取TAO患者及正常人的眼外肌組織，因標(biāo)本量少故采取組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得穩(wěn)定傳代的眼眶成纖維細(xì)胞，免疫組化的方法鑒定。
　　2、用MTT法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時及72小時后細(xì)胞的活性。
　　3、ELISA法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時及72小時后8-OHdG指標(biāo)的變化。
　　4、分光光度計法

4、檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時及72小時后MDA指標(biāo)的變化。
　　5、酶標(biāo)儀法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時后ROS指標(biāo)的變化
　　6、RT-PCR法檢測香煙煙霧提取物及尼古丁作用于眼眶成纖維細(xì)胞24小時后NF-kB相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、本實驗成功通過組織塊法原代培養(yǎng)眼外肌來源的成纖維細(xì)胞，能夠穩(wěn)定傳代，且經(jīng)過鑒定為眼眶成纖維細(xì)胞，能夠成功建立細(xì)

5、胞系后作為甲狀腺相關(guān)性眼病的細(xì)胞模型，為后續(xù)試驗提供可能。
　　2、MTT檢測結(jié)果顯示24小時刺激，TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞在CSE刺激下細(xì)胞活力下降幅度更大，而在72小時刺激條件下，低濃度和高濃度的尼古丁呈現(xiàn)了相似的殺傷性?？梢娢鼰煹膿p傷作用隨刺激時間的增強呈一定的累積作用。
　　3、在24小時刺激條件下，尼古丁10ug/ml可顯著升高兩種細(xì)胞體內(nèi)8-OHdG的含量;在72小時刺激條件下，CSE單獨刺激和低濃度尼古丁即可引

6、起8-OHdG產(chǎn)生的增加，可見高劑量的尼古丁可在短時間內(nèi)即可促進(jìn)8-OHdG含量的突然上升，而低劑量的尼古丁導(dǎo)致8-OHdG的緩慢積累。
　　4、在同時給予CSE和尼古丁10ug/ml刺激之后，MDA含量相比CSE單獨刺激以及陰性對照組均有顯著的增加。在72小時刺激之后，觀察細(xì)胞體內(nèi)MDA含量變化，所有刺激條件對比陰性對照組MDA表達(dá)均有大幅度的增加。
　　5、吸煙可通過增加ROS含量發(fā)揮作用。高濃度尼古丁的作用效果最明顯。

7、
　　6、在TAO患者眼眶成纖維細(xì)胞中，CSE刺激之后NF-κB RNA水平顯著性上調(diào)。可見吸煙通過上調(diào)NF-κB基因的表達(dá)發(fā)揮作用。
　　結(jié)論:
　　吸煙可導(dǎo)致眼眶成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、8-OHdG及ROS增高，且尼古丁作為香煙中的主要毒性成分發(fā)揮作用，即使低濃度的尼古丁，也可隨時間累積而發(fā)揮較強的作用，說明吸煙可通過引起氧化應(yīng)激而參與TAO病理過程。其中可能的分子通路為NF-κB，吸煙可上調(diào)NF-κB基因的