Toll樣受體3、9在皮膚中的作用機(jī)制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究及藥物的干預(yù).pdf

1、本研究通過體外培養(yǎng)人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞(FB)，應(yīng)用免疫組化、real-time PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Western blotting方法考察TLR3、TLR9在兩種細(xì)胞上的表達(dá)特征。在確定TLR3、TLR9存在的基礎(chǔ)上，研究TLR3、TLR9的配體poly(I:C)、ODN2216 等刺激因素對兩種細(xì)胞TLR3、TLR9的表達(dá)調(diào)控，并探討對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機(jī)制。 第一部分 TLR3、TLR9在H

2、aCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞中的表達(dá)及配體識別 1．免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：正常HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞均有TLR3、TLR9陽性表達(dá)。 2．real time-PCR結(jié)果顯示：HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞均有TLR3、TLR9的表達(dá)，且這種表達(dá)可以被LPS、poly(I:C)、ODN2216 顯著增強(qiáng)，并且表現(xiàn)出了配體特異性。 3．FC的結(jié)果顯示：與同型對照相比，TLR3、TLR9在HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞均有顯著的陽性表

3、達(dá)。不同刺激因素對HaCaT細(xì)胞表面TLR3的蛋白表達(dá)均有影響。 4．western blotting的結(jié)果顯示：TLR3蛋白在HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞上均有表達(dá)，且其表達(dá)可被不同刺激因素調(diào)控。其中poly(I:C)和LPS均可顯著增加HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞上TLR3的表達(dá)量，而ODN2216對 2 種細(xì)胞無顯著影響。 上述研究表明，HaCaT細(xì)胞和 FB 細(xì)胞中表達(dá)了在天然免疫中起到關(guān)鍵作用的TLR3、TLR9，提示

4、HaCaT細(xì)胞和 FB 細(xì)胞在皮膚天然免疫和獲得性免疫發(fā)揮著重要作用。 第二部分TLR3、TLR9 對 HaCaT 和 FB 細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α及MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機(jī)制研究 1．real time-PCR結(jié)果顯示：從mRNA水平檢測正常HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞均有IFN-γ，IL-4 和MyD88的表達(dá)。 2．ELISA測定了poly(I:C)，LPS和ODN2216刺激HaCaT細(xì)胞和FB

5、細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4的分泌時效關(guān)系。結(jié)果表明：HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞在正常狀態(tài)下可分泌一定量的IFN-γ和IL-4，當(dāng)給予poly (I:C)、ODN2216和LPS刺激0、6、12、24、48h后，細(xì)胞上清液中IFN-γ和IL-4的濃度分別為有不同程度的增加，但I(xiàn)FN-γ的增加更為顯著。 3．western blotting的方法半定量分析了不同配體作用于2種皮膚細(xì)胞時，MyD88的表達(dá)變

6、化，實驗結(jié)果進(jìn)一步證明了MyD88在2種細(xì)胞均有表達(dá)，且這種表達(dá)可以隨著TLR3、TLR9識別配體而特異性的增加。 通過本部分的研究證明配體與TLR3、TLR9的作用，不但可以影響受體的表達(dá)，還可以進(jìn)一步通過激活獲得性免疫，影響細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng)，并且受體的激活和細(xì)胞因子的分泌是通過影響MyD88的表達(dá)實現(xiàn)的。因此可通過藥物干預(yù)TLR3、TLR9的表達(dá)，具有影響細(xì)胞因子分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的雙重作用，這在影響皮膚

7、的免疫性疾病的防治中具有重要意義。也進(jìn)一步證實了TLR3、TLR9在介導(dǎo)天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮著重要的作用。將天然免疫和獲得性免疫以有機(jī)整體的方式研究，將為免疫學(xué)研究展開新的篇章。 第三部分IFN-γ、TNF-α和EGF對HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞TLR3、TLR9及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機(jī)制研究 1．采用real time-PCR法檢測IFN-γ (50ng·mL<'-1>)、TNF-α (100ng·mL<'-1>

8、) 和 EGF(10ng·mL<'-1>)分別與HaCaT細(xì)胞、FB細(xì)胞作用24h時TLR3、TLR9和MyD88mRNA表達(dá)情況，結(jié)果表明2種細(xì)胞的TLR3、TLR9和MyD88均出現(xiàn)了一定程度的增加，這種增加從2<'5>-2<'8>倍不等。 2．通過流式細(xì)胞術(shù)，檢測IFN-γ (50ng·mL<'-1>)、TNF-α (100ng·mL<'-1>) 和 EGF(10ng·mL<'-1>)與HaCaT細(xì)胞、FB細(xì)胞作用24h時

9、，TLR3、TLR9在HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞胞膜及胞內(nèi)和膜受體的總量。 3．采用Western Blotting 的方法研究IFN-γ (50ng·mL<'-1>)、TNF-α (100ng·mL<'-1>)和EGF (10ng·mL<'-1>)與HaCaT細(xì)胞、FB細(xì)胞作用24h時，TLR3、TLR9在蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常HaCaT細(xì)胞相比，IFN-γ、TNF-α可顯著性的增加MyD88的表達(dá)，而EGF的作用則相

10、對的更為明顯。 本部分研究證實IFN-γ，TNF-α和EGF可一定程度或者以不同方式影響TLRs及其信號通路，這為大分子物質(zhì)透皮和經(jīng)皮免疫治療提供了新的藥物作用靶點，為進(jìn)一步開發(fā)新型疫苗、預(yù)防和治療免疫相關(guān)疾病提供新的思路。 第四部分免疫抑制劑對HaCaT細(xì)胞TLR3、TLR9及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機(jī)制研究 1．real time-PCR結(jié)果顯示：DEX、FK506和MPA不能影響HaCaT細(xì)胞TLR3、TLR9

11、和MyD88的表達(dá)。當(dāng)與poly(I:C)共孵育的情況下，DEX可以顯著增加TLR3、MyD88的表達(dá)，而FK506則對其表達(dá)沒有明顯影響。DEX和poly(I:C)共孵育時可以顯著增加TLR9的表達(dá)。 2．FC 的結(jié)果顯示：與同型對照相比，DEX、FK506 和 MPA 不能影響HaCaT細(xì)胞膜和膜及胞內(nèi)TLR3、TLR9的表達(dá)，當(dāng)DEX與poly(I:C)共同作用于HaCaT細(xì)胞時，相對poly(I:C)而言，在破膜情況下可

12、顯著增加 TLR3 的表達(dá)，但與FK506 和 MPA 則對TLR3的表達(dá)無顯著影響。poly(I:C)、ODN2216及其與FK506和MPA一起作用于HaCaT細(xì)胞，均不影響TLR3的胞內(nèi)表達(dá)，然而DEX在和poly(I:C)共同作用時，可顯著增加TLR3在HaCaT細(xì)胞的胞內(nèi)表達(dá)。 3．westem blotting的結(jié)果顯示：DEX、MPA可以顯著增加poly (I:C)、ODN2216引起的MyD88表達(dá)的增加，而FK

13、506未表現(xiàn)出對TLR3、TLR9及其信號通路的影響作用。 4．ELISA 結(jié)果顯示：DEX、FK506和MPA對HaCaT細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ均無顯著性影響 (除MPA組12h出現(xiàn)顯著的抑制作用)，但在與poly(I:C)共同作用時，相對于 poly(I:C)，DEX和MPA均可顯著的抑制不同時間的IL-4分泌。 研究結(jié)果提示，DEX的抗炎免疫作用有可能是直接通過TLR3、TLR9及其相關(guān)信號通路發(fā)揮作用，也可

14、能是與GR作用，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路反饋調(diào)節(jié)TLR3、TLR9發(fā)揮作用的，尚待進(jìn)一步研究。而MPA、FK506也可一定程度上通過抑制皮膚細(xì)胞TLR3、TLR9的表達(dá)，促進(jìn)皮膚細(xì)胞因子及趨化因子的分泌，降低趨化因子的表達(dá)，影響MyD88信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑發(fā)揮作用。 第五部分 TLR9 及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在乙肝 DNA 疫苗經(jīng)皮免疫中的作用機(jī)制研究 1．構(gòu)建真核表達(dá)載體pVAX/HBS-CpG，考察其經(jīng)皮免疫的效果。 2．初次

15、免疫后的2周進(jìn)行了加強(qiáng)免疫，測定了小鼠血清中IFN-γ和IL-4的含量。 3．采用real-time PCR的方法檢測普通pVAX /HBS質(zhì)粒脂質(zhì)體及pVAX/HBS-CpG質(zhì)粒脂質(zhì)體(10μg/ml)對HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞表達(dá)TLR3、TLR9的干預(yù)。 4．采用FC方法檢測普通pVAX/HBS質(zhì)粒脂質(zhì)體及pVAX/HBS-CpG質(zhì)粒脂質(zhì)體(10μg/ml)對HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞TLR3、TLR9在胞膜和胞內(nèi)的

16、表達(dá)。 5．采用 Western Blotting 方法考察了普通 pVAX/HBS 質(zhì)粒脂質(zhì)體及 pVAX/HBS-CpG 質(zhì)粒脂質(zhì)體(10μg·mL<'-1>)對HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞MyD88連接蛋白的表達(dá)。 6．采用ELISA的方法檢測了普通pVAX/HBS質(zhì)粒脂質(zhì)體及pVAX/HBS-CpG質(zhì)粒脂質(zhì)體(10μg·mL<'-1>)對HaCaT細(xì)胞和FB細(xì)胞Th1型和Th2型細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-4)分泌的

17、時效關(guān)系。 上述結(jié)果說明該脂質(zhì)體有更好的靶向性和更有效誘發(fā)免疫的作用，可用于局部給予質(zhì)粒DNA預(yù)防乙肝，深入研究其免疫機(jī)制，為免疫的設(shè)計和加強(qiáng)提供參考依據(jù)。研究結(jié)果揭示了免疫接種可以通過加強(qiáng)對TLRs的作用而增強(qiáng)免疫，為進(jìn)一步開發(fā)經(jīng)皮免疫劑型奠定了理論基礎(chǔ)，也為大分子物質(zhì)靶向皮膚給藥提供了理論和實踐基礎(chǔ)。 總之，通過本課題的研究，從不同水平系統(tǒng)闡明了TLR3、TLR9受體在皮膚中的作用機(jī)制及其在經(jīng)皮免疫和免疫抑制方面的調(diào)