PKR-EIF2α信號傳導通路與宮頸癌關系研究.pdf

1、目的:
　　 探討HPV（16/18）E6蛋白對PKR/EIF2a信號傳導通路中PKR、p-PKR、p-EIF2a在各級別宮頸病變組織的定位及表達的影響，四者的表達差異與宮頸病變級別的相關性及對宮頸癌患者預后的影響；設計并構(gòu)建以HPV18E6癌基因及無關序列（NC序列）為靶點的shRNA干擾序列的慢病毒載體（HPV18E6-RNAi-LV，NC-GFP-LV）；以HPV18E6-RNAi-LV及NC-GFP-LV為工具轉(zhuǎn)染HeL

2、a細胞，研究在干擾HPV18E6癌基因表達的基礎上，篩選出可能參與調(diào)節(jié)PKR/EIF2a信號傳導通路活性的靶分子，為進一步探索高效激活PKR/EIF2a信號傳導通路的方法提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一部分：采用免疫組化法檢測HPV（16/18）E6、PKR、p-PKR、p-EIF2a在63例宮頸癌、114例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變（CINⅠ～CINⅢ）、15例正常宮頸組織中的定位及表達，分析HPV（16/18）E6蛋

3、白對PKR/EIF2a信號傳導通路活性的影響，四者在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，對宮頸癌患者預后的影響。
　　 第二部分：根據(jù)目的基因的相關信息，構(gòu)建含有shRNA的重組質(zhì)粒載體并鑒定：提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒：將重組質(zhì)粒載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行病毒包裝，收集病毒液并進行濃縮、純化；所得病毒液感染293T細胞，測定病毒滴度。
　　 第三部分：使用HPV18E6-RNAi-LV及NC-GFP-

4、LV慢病毒載體轉(zhuǎn)染HeLa細胞，以RT-PCR、Western Blot法分別在核酸、蛋白水平（包括磷酸化型）檢測轉(zhuǎn)染前后HPV18E6、PKR、EIF2a、NF-κBp65、STAT1、MAPK、JNK1的表達，篩選出可能參與調(diào)節(jié)PKR/EIF2a信號傳導通路活性的靶分子；以MTT法、Transwell侵襲實驗檢測轉(zhuǎn)染前后宮頸癌HeLa細胞活性及侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分
　　 1、HPV（

5、16/18）E6蛋白主要定位于細胞核中，PKR、p-PKR、p-EIF2a蛋白主要定位于細胞質(zhì)中；
　　 2、HPV（16/18）E6蛋白與PKR在各組的陽性表達率隨宮頸病變級別升高而升高，并與宮頸病變級別呈正相關（P<0.05）；P-PKR、P-EIF2a在各組的陽性表達率隨宮頸病變級別升高而先升高、后下降；在宮頸癌組，PKR的陽性表達率明顯高于P-PKR（P<0.01）；
　　 3、宮頸癌患者臨床分期晚者病情進展快（

6、P<0.01），HPV（16/18）E6陽性表達者病情進展快（P<0.05），p-PKR、P-EIF2a陰性表達者病情進展快（P<0.05，P<0.05）。
　　 第二部分
　　 1、經(jīng)BLASTER同源性檢索，HPV18E6的shRNA干擾序列與人類基因組沒有同源性。HPV18E6、NC序列的shRNA干擾序列的正反義鏈轉(zhuǎn)錄后得到的RNA二級結(jié)構(gòu)能形成環(huán)狀發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)；
　　 2、攜帶HPV18E6、NC序列的s

7、hRNA序列陽性克隆經(jīng)測序鑒定比對后，陽性克隆即為構(gòu)建成功的慢病毒載體：
　　 3、成功進行慢病毒包裝、收獲及濃縮，經(jīng)慢病毒滴度測定，HPV18E6-RNAi-LV滴度：3E+8 TU/ml NC-GFP-LV滴度：2E+9 TU/ml。
　　 第三部分
　　 1、轉(zhuǎn)染組HPV18E6、NF-κBp65 mRNA表達量明顯低于空白對照組及陰性對照組（p<0.05，p<0.05）；轉(zhuǎn)染組PKR mRNA表達量明顯高

8、于空白對照組及陰性對照組（p<0.05）；EIF2a、STAT1、MAPK、JNK1 mRNA表達量在各組間的比較無顯著性差異（p>0.05）；
　　 2、轉(zhuǎn)染組HPV18E6、NF-κBp65蛋白的表達量明顯低于空白對照組及陰性對照組（p<0.05，p<0.05）；轉(zhuǎn)染組P-STAT1、PKR蛋白的表達量明顯高于空白對照組及陰性對照組（p<0.05，p<0.05）；轉(zhuǎn)染組P-PKR、p-EIF2a蛋白的表達量顯著高于空白對照組

9、及陰性對照組（p<0.01，p<0.01）；STAT1、MAPK、P-MAPK、JNK1、p-JNK1蛋白的表達量在各組間的比較無顯著性差異（p>0.05）；
　　 3、轉(zhuǎn)染組細胞活性抑制率39.6％，細胞侵襲抑制率56.2％，明顯高于空白對照組及陰性對照組（p<0.05，p<0.05），空白對照組與陰性對照組比較，無顯著性差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、HPV（16/18）E6蛋白能通過使p-P

10、KR、p-EIF2a去磷酸化的方式抑制PKR/EIF2a信號傳導通路激活，阻止病變細胞凋亡，促進宮頸病變進展；PKR/EIF2a信號傳導通路有效激活，能夠抑制宮頸癌患者病情進展，改善其預后；
　　 2、成功構(gòu)建了HPV18E6-RNAi-LV和NC-GFP-LV慢病毒載體，為后續(xù)研究工作提供了實驗工具。
　　 3、降低HPV18E6癌基因的表達水平可增加PKR的表達，恢復PKR/EIF2a信號傳導通路活性，抑制HeLa細