MiR-374a在非小細(xì)胞肺癌中的表達、功能及分子機制的初步研究.pdf

1、肺癌是全球發(fā)病率最高的腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占85％，臨床癥狀出現(xiàn)時，多已發(fā)展到中晚期，5年生存率小于15％。對中晚期肺癌患者而言，傳統(tǒng)的治療方法效果不理想，延長生存期有限。通過對肺癌基因及其作用機制的研究，實施精準(zhǔn)分子靶向治療成為當(dāng)前有前景的重要研究方向。
　　microRNA(miRNA)是具有調(diào)控功能的非編碼小RNA，主要通過直接調(diào)節(jié)細(xì)胞生長或作用于轉(zhuǎn)錄因子、信號通路阻斷細(xì)胞程序性死亡，發(fā)揮類似于癌基因或抑癌

2、基因的功能。其中，miR-374a已被報道在骨肉瘤，結(jié)腸癌，乳腺癌和胃癌中發(fā)揮癌基因作用。但數(shù)項miR-374a在肺癌的作用研究報道結(jié)果并不一致，這表明miR-374a在肺癌中作用復(fù)雜，其究竟扮演何種角色，其調(diào)節(jié)的具體信號通路需要深入研究探討?；诖?，本課題的目的是研究miR-374a在非小細(xì)胞肺癌中的功能、其參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為NSCLC發(fā)病機制提供新思路，為診斷和治療提供新的策略。
　　我們首先用慢病毒載體在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞

3、中過表達miR-374a，轉(zhuǎn)染miR-374a mimics和inhibitors，應(yīng)用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染前后miR-374a的表達情況;應(yīng)用MTT，平板克隆，流式細(xì)胞術(shù)，Edu，Transwell，Boyden，裸鼠皮下成瘤，裸鼠肝包膜等方法檢測miR-374a轉(zhuǎn)染前后非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移變化;再通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖esternblot實驗驗證miR-374a能直接結(jié)合CCND1和PTEN的3'UTR端;

4、用Westernblot實驗檢測miR-374a調(diào)控之信號通路蛋白;通過原位雜交和免疫組化方法檢測miR-374a和CCND1以及PTEN在非小細(xì)胞肺癌的表達，并分析兩兩之間的相互關(guān)系。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):1，穩(wěn)定過表達miR-374a可以抑制A549細(xì)胞增殖、克隆和體內(nèi)成瘤能力，但促進SPCA-1和H1975細(xì)胞增殖、克隆和體內(nèi)成瘤能力。miR-374aInhibitors能夠逆轉(zhuǎn)穩(wěn)定過表達或瞬時過表達miR-374a后A549、S

5、PCA-1和H1975細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。2，A549細(xì)胞中miR-374a能夠直接靶向CCND1和PTEN的3'UTR區(qū)，過表達miR-374a后，A549細(xì)胞中CCND1的表達下調(diào)，而SPCA-1和H1975細(xì)胞中PTEN表達下調(diào)，瞬時轉(zhuǎn)染miR-374a inhibitor后能夠逆轉(zhuǎn)這一作用。3，Western blot檢測穩(wěn)定過表達miR-374a后A549細(xì)胞中pPI3K、pAkt、c-Myc、CDK4及N-cadhe

6、rin的表達下調(diào);P21及E-cadherin的表達則上調(diào)，miR-374a inhibitor能逆轉(zhuǎn)相關(guān)蛋白表達。穩(wěn)定過表達miR-374a后SPCA-1和H1975細(xì)胞中β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc、P21和N-cadherin的表達上調(diào);而P21的表達則下調(diào)。miR-374a inhibitor能逆轉(zhuǎn)過表達相關(guān)蛋白的表達。4，瞬時干擾CCND1后，A549細(xì)胞中pPI3K、pAkt、c

7、-Myc、CDK4及N-cadherin的表達下調(diào);E-cadherin和P21表達上調(diào)。，瞬時干擾PTEN后SPCA-1和H1975細(xì)胞中β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、TCF4、c-Myc、P21和N-cadherin的表達上調(diào);而P21的表達下調(diào)。5，早期NSCLC肺組織中高表達miR-374a的患者預(yù)后好，晚期NSCLC肺組織中高表達miR-374a則不利于預(yù)后，低表達miR-374a與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。