miR-542-5p在非小細(xì)胞肺癌中的臨床意義及初步機(jī)制研究.pdf

1、作為新一類的分子靶向標(biāo)志物，微小RNA（microRNA，miRNA）在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的診斷和生物治療上的應(yīng)用前景非常廣闊。目前已發(fā)現(xiàn)若干直接或間接與NSCLC的發(fā)生和發(fā)展、診斷、分期、進(jìn)展和預(yù)后等相關(guān)的miRNAs，但許多miRNA與NSCLC的相互關(guān)系及分子機(jī)制仍不明確，故探求miRNA在NSCLC中的作用機(jī)制已成為當(dāng)前研究的熱點和重點。miR-542-5p與腫瘤的關(guān)

2、系研究不多，已有研究發(fā)現(xiàn)miR-542-5p在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá)，與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，體外實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-542-5p可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，推測miR-542-5p可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中行使“抑癌”miRNA的功能。但到目前為止，miR-452-5p在NSCLC人群中的研究未見報道。因此，本課題將探討miR-542-5p在NSCLC中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的意義，預(yù)測miR-542-5p靶基因網(wǎng)

3、絡(luò)，繼而構(gòu)建雞胚絨毛尿囊膜移植瘤（Chick Chorioallantoic membrane，CAM）動物模型,探索miR-542-5p在NSCLC細(xì)胞生長，血管生成的作用及初步分子機(jī)制，為進(jìn)一步開展NSCLC的腫瘤生物學(xué)相關(guān)研究提供了良好的技術(shù)平臺。
　　目的：⑴檢測miR-542-5p在 NSCLC細(xì)胞及組織中的表達(dá)及臨床意義。⑵利用生物信息學(xué)預(yù)測并分析miR-542-5p的靶基因網(wǎng)絡(luò)并行信號通路等分析。⑶使用體內(nèi)實驗（CA

4、M），探討miR-542-5p在NSCLC腫瘤細(xì)胞生長及血管生成中的作用及潛在機(jī)制。
　　方法：①收集125例NSCLC及癌旁非癌肺組織樣本，其中101例肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD），23例肺鱗癌（Lung squamous cell carcinoma，LUSC），采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-542-5p的表達(dá)水平，分析miR-542-5p的表達(dá)與NSCLC的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，初步探討

5、miR-542-5p在NSCLC中的臨床意義。②通過miRNA預(yù)測軟件（miRWalk，miRanda，Microt4，miRDB，mirbridge，miRMap，RNAhyb rid，miRNAMap，PITA，Pictar2，RNA22，TargetScan）預(yù)測miR-542-5p的靶向作用基因，利用DAVID分別進(jìn)行GO富集分析、KGEE通路分析、PANTHER通路分析。③用軟件Cytoscape_v3.3.0繪制GO分析網(wǎng)絡(luò)

6、圖，在http://string-db.org/網(wǎng)站上繪制靶蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，并提取hub gene。④通過GSEA軟件構(gòu)建的分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫（Molecular Signatures Database，MSigDB）對452個靶基因進(jìn)行富集分析。通過來源于National Cancer Institute的NCI-60 cell lines的數(shù)據(jù)，以基因表達(dá)圖譜的形式進(jìn)行靶基因注釋，在定義的功能分組中顯示相互的表達(dá)趨勢。⑤實時熒光定量PCR方

7、法檢測四株肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、PC9、H1299、H460）中篩選出miR-542-5p表達(dá)量最低的肺癌細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染。⑥構(gòu)建 LV-hsa-miR-542的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞株H460，構(gòu)建miR-542-5p的過表達(dá)細(xì)胞模型。⑦通過構(gòu)建NSCLC CAM模型從動物模型角度模擬人體 NSCLC的生長發(fā)展，測量瘤塊大小，并利用Image-Pro Plus軟件測量不規(guī)則血管面積及開窗面積，計算比值，包埋瘤塊制成石蠟組織后，組織切片

8、常規(guī)HE染色和免疫組化表皮生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、D2-40染色，以研究miR-542-5p對NSCLC腫瘤形成和血管生成的影響，進(jìn)一步初步探討其在腫瘤中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：⑴miR-542-5p在125例NSCLC中的癌組織（1.952±1.507）中表達(dá)低于

9、癌旁非癌肺組織（4.568±1.993）（t=-11.703，P<0.001）；在101 LUAD中的癌組織中的表達(dá)（1.868±1.472）顯著低于癌旁非癌組織（4.682±2.056；t=-11.183，P<0.001）；在23例LUSC癌組織中的表達(dá)（2.355±1.647）顯著低于癌旁非癌組織（4.103±1.851；t=-3.383，P=0.002）。ROC曲線示在NSCLC石蠟組織中miR-542-5p曲線下面積為0.799

10、（95％CI0.721~0.877，P<0.001），其中在LUAD組織中miR-542-5p曲線下面積為0.832（95%CI0.753~0.911，P<0.001）。⑵在125例NSCLC病人中，miR-542-5p在TNM分期Ⅲ-Ⅳ中的表達(dá)水平（1.292±1.101）低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ（2.822±1.536；t=6.488，P<0.001），在有血管浸潤陽性者（1.475±1.305）的表達(dá)低于血管浸潤陰性組（2.138±1

11、.545；t=2.247，P<0.001）的病人，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組（1.504±1.266）中的表達(dá)低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組（2.506±1.604；t=3.905，P<0.001）。Spearman相關(guān)性分析表明，miR-542-5p的表達(dá)水平與TNM分期（r=-0.505，P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=-0.332，P<0.001）及血管浸潤（r=-0.199，P=0.026）呈負(fù)相關(guān)。⑶在101例LUAD病人中，miR-542-

12、5p在TNM分期Ⅲ-Ⅳ中的表達(dá)水平（1.142±0.935）低于TNM分期Ⅰ-Ⅱ（2.810±1.516；t=6.417，P<0.001）的病人，在有血管浸潤（1.375±1.30）中的表達(dá)低于無血管浸潤（2.087±1.497；t=2.286，P=0.024）的病人，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（1.333±1.095）中的表達(dá)低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（2.085±1.085；t=-2.477，P=0.027）的病人，在有吸煙史的病人（3.065±1.54

13、2）中的表達(dá)高于無吸煙史的（2.535±1.616；t=4.265，P<0.001）。Spearman指數(shù)分析表明，miR-542-5p的表達(dá)水平與TNM分期（r=-0.564，P<0.001）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（r=-0.408，P<0.001）及血管浸潤（r=-0.224，P=0.024）呈負(fù)相關(guān)。⑷在23例LUSC病人中，miR-542-5p的表達(dá)水平與臨床特征相關(guān)性不明顯。⑸在NSCLC組織中，miR-542-5p在EGFR陽性組（0

14、.739±0.407）中的表達(dá)顯著低于EGFR陰性組（3.049±1.194；t=7.753，P<0.001）的病人，Spearman相關(guān)分析結(jié)果示EGFR蛋白表達(dá)與miR-542-5P呈負(fù)相關(guān)(r=-0.723，P<0.001)。其中在LUAD組織中miR-542-5p在EGFR陽性組（0.836±0.373）中的表達(dá)低于EGFR陰性組(3.180±0.952；t=10.098，P<0.001)的病人，Spearman相關(guān)分析結(jié)果示E

15、GFR蛋白表達(dá)與miR-542-5P呈負(fù)相關(guān)（r=-0.818，P<0.001)；在LUSC組織中miR-542-5p在EGFR陽性組（0.436±0.345）中的表達(dá)低于EGFR陰性組（2.888±1.448；t=6.543，P<0.001)的病人，Spearman相關(guān)分析結(jié)果示EGFR蛋白表達(dá)與miR-542-5P呈負(fù)相關(guān)（r=0.828，P<0.001)。⑹以miR-542-5p在NSCLC組織中的表達(dá)量的中位數(shù)（3.260±2.

16、197）為分度將其分為高表達(dá)組（4.568±1.993）和低表達(dá)組（1.953±1.507）。K-M生存曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-542-5p低表達(dá)組的50例NSCLC病人（11.274±1.387 months）與高表達(dá)組的7例病人（35.714±3.469 months）相比，預(yù)后更差（t=-6.219，P<0.001)。⑺通過12個預(yù)測軟件預(yù)測出57233個miR-542-5p預(yù)測靶基因，按至少同時出現(xiàn)在六個軟件預(yù)測為條件，篩選出452

17、個靶基因。⑻DAVID軟件測出miR-542-5p預(yù)測的GO分析結(jié)果中，生物過程GO分析（GOTERM_BP_FAT）中有147條通路信息，其中最顯著的前三條通路如下：RNA聚合酶引物調(diào)控的轉(zhuǎn)錄通路（regulation of transcription from RNA polymerase II promoter；GO:0006357，P=0.002）；蛋白質(zhì)定位通路（protein localization；GO:0008104，

18、P=0.002）；Wnt受體信號通路（Wnt receptor signaling pathway；GO:0016055，P=0.002）。細(xì)胞組成GO分析（GOTERM_CC_FAT）中有15條，其中排前三條通路如下：神經(jīng)元投射通路（neuron projection；GO:0043005，P=0.003）；突觸調(diào)控通路（synapse；GO:0045202，P<0.001）；體元投射（cell projection；GO:00429

19、95，P<0.001）。分子功能GO分析（GOTERM_MF_FAT）中有37條，其中三條最顯著通路如下：蛋白質(zhì)糖基綁定（protein C-terminus binding；GO:0008022，P=0.003）；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性（transcription regulator activity；GO:0030528，P=0.017）；蛋白質(zhì)自聯(lián)（protein self-association；GO:0043621，P=0.037）。⑼

20、DAVID軟件測出miR-542-5p參與的KEGG通路分析13條通路信息，其中三條最顯著為：卵母細(xì)胞成熟分裂調(diào)控通路（Oocytemeiosis；hsa04114，P=0.01）；擴(kuò)張性心肌病調(diào)控通路（Dilated cardiomyopathy；hsa05414，P=0.012）；黑素原生成調(diào)控通路（Melanogenesis；hsa04916，P=0.018）。⑽DAVID軟件測出miR-542-5p參與的PANTHER通路分析有

21、12條通路信息，其中參與的最顯著三條通路為：GABA-B II受體信號（GABA-B receptor II signaling；P05731，P=0.001）；谷氨酸受體組第三途徑（Metabotropic glutamate receptor group III pathway；P00039，P=0.013）；胰島素/胰島素樣生長因子通路蛋白激酶B信號級聯(lián)(Insulin/IGF pathway-protein kinase B s

22、ignaling cascade；P00033，P=0.024)。⑾452個靶基因在String上分析結(jié)果顯示：GO分析中miR-542-5p參與的生物過程通路（GOTERM BP FAT）中有121有意義的作用結(jié)果（P<0.05），其中參與的前三條依次為神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展（nervous system development）（GO:0007399），神經(jīng)（nervous）（GO:0022008），細(xì)胞分化（cell differenti

23、ation）（GO:0030154）；細(xì)胞組成通路（GOTERM CC FAT）中有20條有意義的作用結(jié)果（P<0.05），其中參與的前三條依次為細(xì)胞反射（cell projection）（GO:0042995），神經(jīng)反射（neuron projection）（GO:0043005），神經(jīng)系統(tǒng)的部分（neuron part）（GO:0097458）；分子功能通路（GOTERM MF FAT）中僅參與蛋白綁定（protein blind）

24、（GO:0005515）的作用（P<0.05）。KEGG通路中有7條作用結(jié)果，其中參與的前三條依次為嗎啡慢性中毒（Morphine addiction）；可卡因成癮（Cocaine addiction），心肌細(xì)胞的腎上腺素信號通路（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）（P<0.05）。并通過網(wǎng)絡(luò)分析及網(wǎng)站評分信息檢測出21個hub gene，分別為RMT8，ADAMTS8，MASP1，HOXC9

25、，ARTN，NPDC1，CASC3，NCD N，ARPC4，PGPEP1，TNNI3K，SLC24A3，EPS8L2，F(xiàn)ARSA，PDDC1，P LEKHM1，UNKL，PRDM9，ISYNA，BCL2L1。⑿通過將靶基因注釋在NCI-60 cell lines不同癌癥細(xì)胞系中的表達(dá)圖譜，顯示出多個靶基因在HOP92，HOP62；NCI-H226；NCI-H23；NCI-H322；NCI-460及EKVX肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，依次為NSD

26、1，ELF4，HOXA9，ABL1，ABL2，NOTCH1，TCF3，SEPT6，NU P214，CRTC1。⒀細(xì)胞選擇：選取miR-542-5p表達(dá)量最低的H460細(xì)胞進(jìn)行移植瘤構(gòu)建。⒁慢病毒轉(zhuǎn)染：選取最佳轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染LV-hsa-miR-542慢病毒（濃度配比virus10μl+ENIS290μl+ploy1.25μl+complete2.2 ml）和空載病毒（濃度配比virus3μl+ENIS300μl+ploy1.25μl+co

27、mplete2.2 ml）后，實時熒光定量PCR檢測H460（空白組），陰性組（空載病毒），LV-hsa-miR-542組中miR-542-5p的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-542-5p在轉(zhuǎn)染組中過表達(dá)，轉(zhuǎn)染有效（P<0.001）。⒂移植瘤結(jié)果統(tǒng)計：于25 ml培養(yǎng)皿中培養(yǎng)空白組，陰性組和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞株，各取兩瓶長勢良好且已滿的細(xì)胞種入雞胚，監(jiān)測其瘤塊和血管生長情況，第0天各組血管長勢良好，第5天，瘤塊大?。恨D(zhuǎn)染組（4.34±0.07 mm3）

28、與空白組（30.13±0.06 mm3）相比，明顯受到抑制（t=543.260，P<0.001），陰性組（30.09±0.07 mm3）與空白組相比，無明顯差異（t=1.312，P=0.260）。⒃血管生成：轉(zhuǎn)染組（8.33±0.08）與空白組（16.94±0.11）相比，明顯受到抑制（t=128.208，P<0.001）；陰性組（16.99±0.20）與空白組（16.94±0.11）相比，無明顯差異（t=-0.612，P=0.573）

29、均受到抑制。⒄HE切片：鏡下示轉(zhuǎn)染組相比對照組，局部浸潤不明顯。通過免疫組化檢測空白組和轉(zhuǎn)染組的EGFR（11.220±0.536；6.680±0.536）、VEGF（7.320±0.370；4.320±0.421）及D2-40（2.020±0.390；1.500±0.255）的表達(dá)情況：LV-hsa-miR-542組中EGFR（t=13.399，P<0.001）、VEGF（t=11.971，P<0.001）及D2-40（t=2.496

30、，P=0.037）的表達(dá)明顯減弱。
　　結(jié)論：①miR-542-5p在NSCLC組織中呈低表達(dá)，在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中具有一定影響，可能發(fā)揮抑癌基因的作用，并對NSCLC可能具有中度診斷價值。②miR-542-5p的GO富集通路分析發(fā)現(xiàn)其分子功能，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物過程及KEGG通路分析和PANTHER通路的相關(guān)靶向作用通路信息，其中對KEGG通路及PANTHER通路中的相關(guān)基因進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)miR-542-5p靶向作用于的VEZ

31、T，KIT，CAMK2D，WEE2，PARVA，LTK，CLCN3最有價值，可進(jìn)行下一步的機(jī)制研究。通過String平臺對miR-542-5p的452個靶基因分析發(fā)現(xiàn)其參與的各通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用很顯著，并可參與相關(guān)如嗎啡類藥物中毒的生理反應(yīng)過程。還通過靶基因注釋發(fā)現(xiàn)了多個靶基因在肺癌細(xì)胞系中呈現(xiàn)出不同程度的高表達(dá)情況。對miR-542-5p的潛在靶向生物信息學(xué)分析為miR-542-5p對疾病發(fā)生發(fā)展的分子靶向作用機(jī)制提供了良好的理論