MiR-222在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值.pdf

1、目的：
　　評(píng)估m(xù)iR-222表達(dá)水平在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中的臨床意義。檢測(cè)NSCLC肺癌組織和鄰近正常組織miR-222的表達(dá)水平；分析miR-222水平與各項(xiàng)臨床參數(shù)的關(guān)系；評(píng)估m(xù)iR-222表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系。分析miR-222水平與鉑類(lèi)藥物耐藥性的關(guān)系以及血漿miR-222水平與肺癌組織miR-222水平的相關(guān)性。
　　方法：
　　1)研究對(duì)象和樣本保存：
　　所有入選研究對(duì)象符合以下標(biāo)

2、準(zhǔn)：入選患者的肺癌組織均經(jīng)過(guò)病理診斷，明確為NSCLC；無(wú)既往癌癥病史；均簽署知情同意書(shū)。例肺癌組織和相對(duì)應(yīng)的距病灶5cm以上的相應(yīng)正常肺組織取自我院收治的肺癌患者。標(biāo)本取材在手術(shù)室內(nèi)無(wú)菌操作，手術(shù)切下后5分鐘內(nèi)取材，并迅速置于液氮凍存。血漿樣本保存于-20度冰箱備測(cè)。
　　所有入選患者接受臨床體格檢查、胸片、胸部、上腹部以及腦部CT掃描、纖支鏡檢查和骨組織掃描。所有患者均未在手術(shù)前接受放化療，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，病人姓名、年齡、

3、性別、吸煙史、家族史等以及臨床病理資料：腫瘤大小、組織類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管瘤栓、胸膜侵犯等各項(xiàng)臨床資料。手術(shù)結(jié)束后，患者開(kāi)始接受隨訪(fǎng)，隨訪(fǎng)5年，從手術(shù)到終點(diǎn)事件（死亡或者隨訪(fǎng)截止）之間的時(shí)間被計(jì)算為生存時(shí)間。
　　2)RNA提取及Realtime-PCR：
　　取液氮保存的肺癌組織或和正常肺組織約100mg，在液氮環(huán)境下研缽研磨：組織塊直接放入研體中，加入適量液氮，迅速研磨；加入trizol，提取組織總RNA。

4、2ugRNA產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，采用SYBR染料法和ABI7500realtime PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。95℃，5min；40個(gè)PCR循環(huán)（95℃，10秒；60℃，20秒；72℃，20秒；78℃，20秒（收集熒光）。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從72℃緩慢加熱到99℃（每5秒升高1℃）。表達(dá)量的變化用公式RQ＝2－ΔCt計(jì)算，其中ΔCt＝（Ct miR-222－Ct U6）。RQ代表相對(duì)表達(dá)量，Ct miR-22

5、2和Ct U6分別代表熒光定量檢測(cè)到的目標(biāo)miRNA和內(nèi)參基因U6的Ct值。采用mi ScriptSYBRGreenPCRKit（Qiagen）和mi ScriptPrime AssaymiR-222對(duì)血漿樣本中的miR-222進(jìn)行實(shí)時(shí)定量熒光擴(kuò)增。表達(dá)量分析方法同上。
　　3)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±S.E.M)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。從手術(shù)到終點(diǎn)事件（死亡或者

6、隨訪(fǎng)截止）之間的時(shí)間被計(jì)算為生存時(shí)間；生存分析采用Kaplan-Meier曲線(xiàn)和Log-Rank檢驗(yàn)；運(yùn)用單因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型初步識(shí)別患者各項(xiàng)指標(biāo)危險(xiǎn)指數(shù)HR,之后運(yùn)用多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型排除混雜因素從而識(shí)別出獨(dú)立的預(yù)后因素和校正HR，分析miR-222與各項(xiàng)臨床指標(biāo)以及術(shù)后生存期的關(guān)系。相關(guān)分析用單因素Pearson分析設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，采取雙側(cè)檢驗(yàn)，雙側(cè)P<0.05認(rèn)為有差異。
　　結(jié)果：
　　1.miR

7、-222在NSCLC患者肺癌組織高表達(dá)
　　RT-PCR結(jié)果顯示對(duì)比鄰近正常肺組織，NSCLC患者肺癌組織miR-222表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。
　　2.miR-222表達(dá)高低與NSCLC患者各項(xiàng)臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系
　　TNM分期I-II期和III期患者，肺癌組織miR-222表達(dá)水平在III期患者明顯高于I-II期患者，累及遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的患者肺癌組織miR-222表達(dá)水平也要高于沒(méi)有累及

8、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的患者(P<0.001)。
　　3.miR-222表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系
　　Kaplan-Meier生存分析顯示miR-222高表達(dá)的NSCLC肺癌患者相對(duì)于低表達(dá)的NSCLC肺癌患者術(shù)后生存期更短，5年生存率為9.37％vs。36.69%（P=0.0025，log-rank test）。單因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型顯示miR-222高表達(dá)是一項(xiàng)預(yù)示NSCLC肺癌患者較差預(yù)后的有意義的指標(biāo)(風(fēng)險(xiǎn)比(HR)=2

9、.7102，P<0.001)，其他臨床病理指標(biāo)包括較高的臨床分期（(HR=3.122，P<0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.123，P<0.001)也被篩選為較差預(yù)后的指標(biāo)。多因素COX風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析排除了混雜因素，miR-222高表達(dá)依然是一項(xiàng)預(yù)示NSCLC肺癌患者較差預(yù)后的有意義的指標(biāo)（(HR=3.31，P<0.001)，較高的臨床分期（(HR=0.76，P<0.001)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=0.68，P<0.001)也是獨(dú)立的不

10、良預(yù)后因素。
　　4.血漿miR-222表達(dá)水平與NSCLC的關(guān)系
　　對(duì)比正常健康者，NSCLC患者血漿miRNA-222水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。對(duì)比化療敏感者，耐藥者血漿miR-222水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01。相關(guān)分析結(jié)果顯示血漿miR-222的表達(dá)水平和肺癌組織miR-22水平呈正相關(guān)(P=0.012；相關(guān)系數(shù)，r=0.575)，該結(jié)果提示了血漿miR-222水平在一定程度