DEK在非小細胞肺癌中的表達及功能研究.pdf

1、前言：
　　 DEK是一種原癌基因,定位在6p22.3染色體,在急性髓系白血病(AML)的一亞型中第一次被報道。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤如視網(wǎng)膜母細胞瘤、肝細胞癌、結腸癌、膀胱癌、宮頸癌、惡性膠質瘤、黑色素瘤以及成年人急性白血病中,DEK蛋白均出現(xiàn)過表達。DEK能部分抑制細胞的分化和過早衰老,并與惡性細胞抗凋亡相關。這些研究提示DEK在腫瘤細胞中有多種功能,是一個重要癌基因。
　　 但是DEK在非小細胞肺癌中的表達情況與臨床病

2、理因素的關系還不清楚,其對肺癌細胞的作用及其作用機制未見文獻報道。我們檢測非小細胞肺癌中DEK的表達情況,分析了DEK表達與臨床病理因素的關系,通過干擾肺癌細胞系A549,SPC中DEK的基因表達,探討了DEK對非小細胞肺癌細胞增殖及凋亡影響。
　　 材料與方法：
　　 1、組織來源
　　 112例原發(fā)性非小細胞肺癌標本及38例相應正常肺組織標本來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科存檔蠟塊,患者術前均未接受放化療。

3、男性72例,女性40例,年齡36～76歲,平均年齡61歲。按2004年WHO肺腫瘤組織學分類標準:鱗癌48例,腺癌64例;高分化41例,中分化47例,低分化24例,有淋巴結轉移43例,無淋巴結轉移69例。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)修訂的肺癌TNM分期標準:Ⅰ期55例,Ⅱ期33例,Ⅲ期24例。
　　 2、免疫組織化學染色
　　 免疫組化檢測試劑盒和濃縮型DAB試劑盒為福建邁新生物工程有限公司產品,DEK多克隆抗體為Pro

4、teinTechGroup中國分公司一武漢三鷹生物技術有限公司產品。操作步驟簡略為:將石蠟組織塊切成4μm厚的切片,脫蠟,脫水,在檸檬酸鹽抗原修復液中修復后,按SP法操作步驟進行,一抗用抗DEK的多克隆抗體(1:200)4℃孵育過夜,生物素標記的二抗37℃孵育30分鐘,DAB顯色,蘇木素染色。為證明DEK蛋白抗體免疫組化檢測的特異性,實驗中以鼠IgG代替一抗作為對照,結果陰性。同時,選擇DEK蛋白陽性染色的切片,以PBS代替一抗的染色結

5、果為陰性作為可信的實驗依據(jù)。
　　 3、免疫組化結果判定標準
　　 結果判定:以棕褐色顆粒位于細胞核內判定為DEK陽性染色結果。并根據(jù)Beesley分級法,按陽性細胞數(shù)的比例將染色結果分為4級。0級:陽性細胞數(shù)為0～5%;1級:陽性細胞數(shù)為6%～25%;2級:陽性細胞數(shù)為26%～50%;3級:陽性細胞數(shù)為50%以上。同時,計算陽性率的方法設定為:(1)陽性率:指1級和1級以上的陽性染色病例百分數(shù);(2)強陽性率:指2級和

6、2級以上的陽性染色病例百分數(shù)。
　　 4、細胞培養(yǎng)和siRNA干擾
　　 人肺腺癌A549細胞系用含有10%胎牛血清和100U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,肺癌細胞系SPC用含有10%胎牛血清和100U/mL青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng),均在37℃,5%CO2條件的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
　　 轉染前24小時將細胞按50%密度接種于6孔板,采用DharmaFECT1轉染試劑進行轉染,轉染48小時后使用PCR和Weste

7、rnblot檢測干擾效率。
　　 5、RT-PCR
　　 對于培養(yǎng)的細胞或者剪碎的組織利用Trizol試劑(Invitrogen,USA)裂解,然后按照說明書的步驟,提取總的RNA。我們使用AMVVer3.0(Takara,Shiga,Japan)試劑盒。PCR產物通過2%的瓊脂糖凝膠電泳,采用(ImageJ)Bio-ImagingSystem進行灰度值測定,以β-actin作為內參。
　　 6、WesternB

8、lot法檢測蛋白表達
　　 收集細胞加入裂解液充分裂解,低溫高速離心(4℃,15000轉/min,15min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60μg。電泳(10%SDS-PAGE凝膠)、轉印(50V,90min)、5%正常小牛血清封閉,抗DEK(1:2000,proteinTech)和抗β-actin(1:500),4℃孵育過夜,分別與對應的二抗(1:4000,santacruz,USA)室溫孵育2h,ECL顯色,結果經自動電

9、泳凝膠成像分析儀(ChemiImager5500,AlphaInnotech,USA)采集,進行灰度值測定。
　　 7、MTT法檢測細胞增殖及集落形成實驗
　　 將單個細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積100μl含3.5×103個細胞,培養(yǎng)24hr,每孔加入MTT(3-[4,5-2-y1]-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)溶液(5mg/ml,Sigma,USA)繼續(xù)培養(yǎng)4hr,吸去上清液

10、,加入150ulDMSO(Sigma,USA),振蕩10min,490nm波長下測定各孔光吸收值,以不含細胞的等體積培養(yǎng)基作對照。繪制細胞生長曲線。集落形成實驗在干擾48小時后接種400個細胞于6cm培養(yǎng)皿中2周后用蘇木素染色.
　　 8、數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析,對DEK表達和臨床病理因素的關系用卡方檢驗;采用t檢驗檢測RT-PCR和WesternBlot結果中的灰度值。以P＜0.0

11、5為差異有意義。
　　 結果：
　　 1、DEK在非小細胞肺癌中過表達
　　 我們采用免疫組化的方法檢測了DEK蛋白在112例非小細胞肺癌組織及38例癌旁正常肺組織中的表達情況。在正常的肺組織中DEK的表達為陰性,38例正常支氣管上皮DEK表達均為陰性。在112例非小細胞肺癌中,DEK的陽性表達率為58.9%(66/112),肺鱗狀細胞癌DEK的陽性表達率為47.9%(23/48),肺腺癌中DEK陽性表達率為67

12、.2%(43/64),陽性信號主要表達于腫瘤細胞細胞核中。與正常組織相比,DEK蛋白在肺癌組織中表達率明顯增高,而且染色強度明顯增強,具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　 2、DEK在非小細胞肺癌中與臨床病理因素相關
　　 對非小細胞肺癌中DEK表達與臨床病理因素關系進行統(tǒng)計分析,我們發(fā)現(xiàn)DEK的陽性表達與年齡、性別、腫瘤大小無顯著關系。DEK的表達與病理組織學分型有關,腺癌中的表達陽性率明顯高于鱗癌,有統(tǒng)計學意義(p

13、=0.040)。DEK的陽性表達與肺癌的分化(p=0.001),淋巴結轉移(p=0.025),p-TNM分期(p=0.017)有著顯著關系。
　　 3、在兩種肺癌細胞系中轉染DEK特異性siRNA抑制肺癌細胞的增殖
　　 我們檢測了7種非小細胞肺癌細胞系中DEK蛋白的表達情況,為了進一步研究DEK的功能,選出肺癌細胞系A549和SPC,然后我們采用DEK特異性的siRNA干擾其在上述兩種細胞中的表達。轉染48小時后,與轉

14、染亂序siRNA的細胞相比,轉染特異性干擾的細胞DEK的表達明顯下降(其中A549干擾效率71%;SPC干擾效率66%)。MTT法測定結果顯示,DEK特異性siRNA轉染的細胞增殖能力明顯低于對照組(P＜0.05)(可以看到第二天開始轉染組與對照組相比,增殖能力下降)。與MTT結果相似,干擾DEK后,A549和SPC細胞的集落數(shù)目明顯下降,對照組比實驗組:A549:(127+-14vs77+-9),SPC(178+-19vs94+-13