雞干擾素刺激基因IFIT5和Viperin在IBDV感染宿主細(xì)胞中的作用機(jī)制研究.pdf

1、傳染性法氏囊病是一種危害3～6周齡雛雞的急性、高度接觸性傳染疾病，該病的病原傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要攻擊法氏囊中未成熟的B淋巴細(xì)胞，造成雞嚴(yán)重的免疫抑制。IBDV是一種雙股雙節(jié)段RNA病毒，其基因組包括A、B兩個(gè)節(jié)段，編碼VP1～VP5五種病毒蛋白。IBDV感染會(huì)影響干擾素刺激基因(Interferon Stimulated Genes,ISGs)的表達(dá)，但目前針對(duì)IBDV與ISG之間關(guān)系的研究還較少。本課題以兩個(gè)IBDV感染

2、時(shí)上調(diào)的ISGs(IFIT5和Viperin)作為研究對(duì)象，分析了其在IBDV感染過程中的作用。
　　IFIT5是雞IFIT家族的唯一成員，本實(shí)驗(yàn)室前期的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)表明，在IBDV感染的DF-1細(xì)胞中IFIT5呈上調(diào)表達(dá)，但目前該基因在Genbank中仍處于預(yù)測(cè)狀態(tài)，未見有關(guān)該基因的功能報(bào)道。本研究從IBDV感染的DF-1細(xì)胞中克隆了雞IFIT5基因，其全長(zhǎng)為1440bp，編碼480個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示其具有IFIT家

3、族蛋白共有的六個(gè)典型TPR結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化分析顯示，雞IFIT5與火雞IFIT5的氨基酸同源性最高，與魚類的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。應(yīng)用原核表達(dá)的雞IFIT5蛋白制備的多克隆抗體，證明poly(I∶C)、IFN-α和IFN-β均可在基因和蛋白水平誘導(dǎo)雞IFIT5表達(dá)，并證實(shí)IFIT5與Mda5之間的相互作用。另外，干擾雞IFIT5能夠抑制IFN-β的產(chǎn)生。
　　為研究雞IFIT5與IBDV感染的關(guān)系，對(duì)IBDV感染后雞IFIT5的動(dòng)態(tài)表達(dá)進(jìn)行了

4、分析。結(jié)果顯示，IBDV感染確實(shí)能夠引起雞IFIT5在體內(nèi)外上調(diào)表達(dá)，且呈IBDV感染劑量依賴性。進(jìn)一步對(duì)IBDV的各編碼蛋白及基因組進(jìn)行過表達(dá)并檢測(cè)雞IFIT5的變化，發(fā)現(xiàn)引起雞IFIT5上調(diào)的病毒因子是病毒蛋白VP1和病毒基因組dsRNA。然而，無論過表達(dá)還是干擾雞IFIT5，IBDV的病毒蛋白及病毒滴度均無明顯變化，說明雞IFIT5沒有影響IBDV的復(fù)制，同時(shí)也提示IBDV可能以某種機(jī)制逃逸了IFIT5的抗病毒作用。作為另一個(gè)具有

5、抗病毒活性的ISG，Viperin在IBDV感染后也會(huì)被刺激上調(diào)。在此也對(duì)Viperin進(jìn)行了過表達(dá)，并分析其對(duì)IBDV復(fù)制的影響。與IFIT5相似，雞Viperin并不影響IBDV在DF-1細(xì)胞中復(fù)制，但人Viperin卻能顯著抑制IBDV在293T細(xì)胞的復(fù)制。進(jìn)一步究其原因，發(fā)現(xiàn)Viperin對(duì)細(xì)胞自噬水平無影響，但可以增強(qiáng)293T細(xì)胞的凋亡，因此推測(cè)Viperin可能是通過誘導(dǎo)凋亡來限制IBDV在293T細(xì)胞復(fù)制。
　　除先

6、天免疫外，細(xì)胞自噬也是機(jī)體對(duì)抗病毒感染的一條途徑，但長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化使病毒具有了對(duì)抗自噬的能力。在此，分析了IBDV病毒蛋白VP4與自噬的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VP4可分布于自噬泡周圍，但與自噬泡標(biāo)志物L(fēng)C3不存在互作。過表達(dá)VP4能夠促進(jìn)LC3由Ⅰ型向Ⅱ型轉(zhuǎn)換，并導(dǎo)致P62累積，說明自噬被VP4所抑制。進(jìn)一步證明VP4可以與自噬相關(guān)蛋白Beclin-1共定位并互作，提示VP4可能通過Beclin-1阻斷了自噬泡與溶酶體的融合或自噬泡在溶酶體中的