干擾素作用下乙型肝炎病毒c基因區(qū)變異機(jī)制的體外研究及hepg2.2.15細(xì)胞在研究中的應(yīng)用

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文干擾素作用下乙型肝炎病毒C基因區(qū)變異機(jī)制的體外研究及HepG2.2.15細(xì)胞在研究中的應(yīng)用姓名：邵光申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：消化內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：周曉東20040526下擾素忤I L J F 己1 ¨_ 病毒c 基訓(xùn)匹變異機(jī)制的體外研究及J | c p G 2 2 ．I5 細(xì)胞在研究中的應(yīng)用 中文摘要％，停藥后隨訪5 —1 0 年，H B e A g 及H B V D N A 陰轉(zhuǎn)率可增至6 0 ％一7 0

2、％，治療后有應(yīng)答者( H B e A g 及H B V D N A 陰轉(zhuǎn)) 預(yù)后較好[ 2 ] ，可以減少肝硬化及肝細(xì)胞癌的發(fā)病率。臨床研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)干擾素治療的乙肝患者會(huì)出現(xiàn)H B V C 基因區(qū)，前c 區(qū)， c 基因啟動(dòng)子突變，關(guān)于干擾素作用下H B V 的突變機(jī)制，大多數(shù)學(xué)者通過(guò)臨床觀察認(rèn)為是H B V 逃避機(jī)體免疫壓力的結(jié)果，但是有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)c 基因熱點(diǎn)變異區(qū)均不在M H C 限制性C T L 識(shí)別區(qū)，最常見(jiàn)的L 9 7 替代甚至

3、與已知的T 或B 表位無(wú)關(guān)，因此將干擾素治療后新產(chǎn)生的H B V 變異完全歸兇于免疫因素是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?。鑒于上述，我們?nèi)コ庖咭蛩氐挠绊?，采用?xì)胞模型就干擾素作用下乙肝病毒C 區(qū)，前c 區(qū)的突變規(guī)律及機(jī)制展開(kāi)系統(tǒng)的體外研究，以探討干擾素直接抗病毒作用與H B V 變異的關(guān)系。前期的試驗(yàn)結(jié)果表明：1 ．在高劑量條件N I F N 一Ⅱ選擇下，能檢測(cè)到H e p G 2 ．2 ．1 5 H B V 前C ／C 基因插入或缺失突變株，突變株與優(yōu)勢(shì)

4、株相比基因序列同源性在9 7 ％以上，因此，可以認(rèn)為該突變株與優(yōu)勢(shì)株同源．；2 ．h l F N ．a(chǎn) 可通過(guò)直接分子作用機(jī)制影響H e p G 2 ．2 ．1 5H B V 的c c c D N A 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)能，導(dǎo)致前C ／C 基因結(jié)構(gòu)的改變．同時(shí)，也可能通過(guò)直接病毒抑制作用，抑制H e p G 2 ．2 ．1 5H B V 優(yōu)勢(shì)株度的復(fù)制，從而導(dǎo)致突變株比例相對(duì)增加；3 ．存在H B V 異質(zhì)性H e p G 2 ．2 ．1 5

5、 細(xì)胞系可作為H B V 變異分子機(jī)制研究的理想細(xì)胞模型，這種細(xì)胞模型內(nèi)存在異質(zhì)性的現(xiàn)象可能會(huì)影響其在基因治療中的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)在前期工作的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討干擾素真接抗病毒的分子機(jī)制及其致H B V 變異機(jī)制及H e p G 2 ．2 ．1 5 細(xì)胞在H B V 基因變異機(jī)制研究中的應(yīng)用價(jià)值。研究目的：1 ．用不同劑量I F N 常時(shí)間作用于H B V 分泌型H e p G 2 ．2 ．1 5 細(xì)胞培養(yǎng)株；通過(guò)定量檢測(cè)不同時(shí)相細(xì)胞培養(yǎng)上清

6、@ H B e A g 、H B V D N A ，探討H B V 基因變異對(duì)病毒蛋白合成及病毒復(fù)制的影響；通過(guò)測(cè)序的方法鑒定高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)上清H B V D N A及細(xì)胞內(nèi)H B v 前基因組R N A C 基因區(qū)變異；用c l u s t a l x 、b l a s t 等軟件綜合分析其突變的規(guī)律及意義，為探討I F N 致H B V C 基因變異的多重機(jī)制提供科學(xué)的依據(jù)。2 ．探討H e p G 2 ．2 ．1 5 細(xì)胞株在H